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浅议基层畜牧兽医站实验室常规ELISA检测 操作注意事项 摘要：介绍了实验室常规ELISA试验的基本原理、 操作要领及注意事项，供基层畜牧兽医站工作人员参考。 关键词：ELISA试验；实验室诊断；操作注意事项 中图分类号：S852. 5+3文献标识码：B文章编号： 1007-273X (2013) 12-0069-02 近年来，随着国家动物疫病检测计划的实施和地方动物 疫病预防控制工作的科学化管理，兽医实验室发挥着越来越 重要的作用。目前兽医实验室诊断主要分三大类：病毒学诊 断、血清学诊断及细菌学诊断。细菌学与病原学检测工作在 基层实验室开展得不多，使用最普遍的是血清学诊断，尤其 是ELISA诊断试剂盒，一次可诊断几十份血清，无论检测抗 体还是抗原，都十分方便、快速有效。对ELISA试验的基本 原理、操作要领及注意事项进行了介绍，供参考。 ELISA的基本原理与类型 ELISA是一种免疫测定技术。免疫测定技术是应用免疫 学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反 应检测体液中的抗体或抗原性物质。ELISA既可用于测定抗 体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤的不同， 有以下四种类型的常用方法：直接法、间接法、双抗体夹心 法、竞争法。 ELISA试验的特点 ELISA试验主要有以下几个特点：①灵敏度高、特异性 强；②方法快速、简便；③重复性好；④自动化程度高，适 合批量标准化检测；⑤安全可靠。 ELISA试验的操作要领[1, 2] 3. 1样品的采取和保存 3. 1. 1样品种类体液、组织、分泌物和排泄物。 3. 1.2样品要求新鲜、无溶血、无沉淀、均匀。 3. 1.3样品采取与保存尽量避免溶血；血清标本的制 备：非抗凝自然凝固1?2 h, 3 000 r/min离心15 min；血 浆标本的制备：使用含有抗凝剂的采血管采血，颠倒混匀放 置一段时间后，3 000 r/min离心15 min；标本宜在新鲜时 检测，若5 d内检测，可使用冰箱于2?8 ￡保存，超过1 周时间测定，应于-20 °C低温冻存；反复冻溶会使抗体效价 跌落，所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测，宜少量 分装冻存。 3.2试剂的准备 严格按要求准备试剂；使用新制的蒸馆水或去离子水； 自配缓冲液应用pH计测量较正；冷藏试剂应平衡至室温后 使用；试剂盒中暂时不用的部分应及时放回冰箱。 3. 3加样 尽量使用多道移液器；微量加样器应注意保养并定期校 正；加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加 在孔壁上部，注意不可出现气泡。加样时避免样本溅出，如 有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。 加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时 间。 3.4保温孵育 3.4. 1温度37 °C、室温（20?25°C）和4 °C；温度要 恒定、准确。 3.4.2保温方式 水浴保温时，ELISA板底应贴着水面， 加盖避免蒸发；保温箱保温时为避免蒸发，用湿盒或用塑料 贴封纸覆盖板孔；反应板不宜叠放。 3.5洗涤 3. 5.1目的清除残留在板孔中未结合的物质；清除非 特异吸附于固相载体的干扰物。 3. 5.2要求洗涤要充分；排净；避免干燥。 3. 6显色和比色 3. 6. 1显色 显色是酶促反应，温度和时间应力求准确; 显色反应应避光进行。 3. 6. 2比色 酶标板的放置要正确；要选用产物的敏感 吸收波长；以空白孔调零或双波长式测读可减少误差。 ELISA试验的常见问题及分析 ELISA操作是需要非常细心的工作。操作者在进行ELISA 操作前应该对试验有充分的了解，并对预期结果十分清楚。 实验室ELISA试验失败的原因有10%左右是由于水质量引起 的，另外90%则是操作上的失误引起的，包括未意识到的操 作失误，或者明知操作原则但想偷懒而未按正确要求操作； 另外，还有少量失败案例是由于设备的管理不当或设备状况 太差引起的[3] o 在大多数ELISA试验中，最终都要通过酶标仪读数。在 得出的数据中可以重点关注阴阳对照的2组数值，这可以在 一定程度上反映试验的重复性和准确性。可以通过计算阴性 对照组和阳性对照组各自的变异系数来反映试验的重复性 和准确性，如果变异系数小于20%则说明操作的重复性较好, 操作较准确，反之则重复性较差，操作不当。也可以通过一 个样品的重复检测来反映试验操作的准确性，这样可以尽可 能排除操作方面的因素对试验结果的影响，提高检测的准确 性。 参考文献： 李纯玲.酶联免疫吸附试验(ELISA)在畜禽饲养 及疾病诊断中的应用[J].当代畜牧，2005 (7)： 20-22. 焦奎，张书圣.酶联免疫分析技术及应用[M].北 京：化学工业出版社，2004. 王海霞，陈婷飞，卢黎明，等?宁波市基层兽医 试验室试剂盒使用现状调查