贵州省仔猪病毒性腹泻流行病学调查及相关基因分析-预防兽医学专业论文.docxVIP

贵州 贵州省仔猪病毒性腹泻流行病学调查及相关基因分析 万方数据 万方数据 目 录 中文摘要 I Abstract III 英文缩略表 VI 文献综述1 试验研究12 第一章 PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 检测方法建立与临床应用 12 1 材料12 1.1 疫苗与试剂 12 1.2 主要仪器12 2 方法13 2.1 引物设计13 PEDV、TGEV 和 RV 三联疫苗总 RNA 的提取 13 PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 方法建立 14 PEDV、TGEV、RV RT-PCR 检测方法验证 15 3 结果16 PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 方法优化 16 PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 方法验证 17 PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 方法临床应用 19 4 讨 论21 4.1 关于猪病毒性腹泻主要病原确诊 21 4.2 关于猪病毒性腹泻检测方法 22 第二章 贵州省仔猪病毒性腹泻流行病学调查23 1 材料23 1.1 血清、病料样本采集 23 1.2 主要实验试剂 23 1.3 主要实验仪器 24 2 方法24 2.1 仔猪病毒性腹泻发病状况调查 24 2.2 仔猪病毒性腹泻临床症状调查 24 2.3 仔猪病毒性腹泻大体病变观察 24 PEDV、TGEV 和 RV 血清抗体检测 25 PEDV、TGEV 和 RV 病原核酸检测 25 3 结果25 3.1 仔猪腹泻发病情况调查结果 25 3.2 仔猪腹泻临床症状调查结果 28 3.3 仔猪腹泻大体病变观察 28 PEDV、TGEV 和 RV 血清抗体检测 29 PEDV、TGEV 和 RV 病原核酸检测 32 3.6 PEDV、TGEV 和 RV 混合感染情况检测结果 33 4 讨论34 4.1 关于 PED、TGE 和 RV 流行情况 34 4.2 关于 PED、TGE 和 RV 混合感染情况 34 4.3 关于仔猪病毒性腹泻疫苗防控情况 35 第三章 猪流行性腹泻病毒(PEDV)分子流行病学调查 36 1 材料36 1.1 病料来源36 1.2 主要实验试剂 36 1.3 主要仪器37 2 方法37 2.1 组织样本总 RNA 提取 37 2.2 PEDV RT-PCR 37 2.3 目的基因的克隆与鉴定 38 2.4 测序鉴定40 2.5 序列比较分析 40 3 结果42 3.1 PEDV S、M 和 ORF3 基因的 RT-PCR 扩增结果 42 3.2 PEDV S、M 和 ORF3 重组质粒酶切鉴定结果 44 3.3 PEDV S、M 和 ORF3 基因测序结果比对分析结果 45 3.4 PEDV S 基因测序及分析结果 46 3.5 PEDV M 基因测序及分析结果 51 3.6 PEDV ORF3 基因测序及分析结果 55 4 讨论60 4.1 PEDV S 基因特点及变异情况分析 60 4.2 PEDV M 基因特点及变异情况分析 60 4.3 PEDV ORF3 基因特点及强弱毒株分析 61 全文结论62 致 谢63 参考文献64 附录一 发表文章 69 附录二 各种培养基、溶液及试剂的配制 70 原 创 性 声 明 71 贵州省仔猪病毒性腹泻流行病学调查及相关基因分析 中文摘要 2010 年以来，贵州省部分地区规模化养猪场猪群出现不同程度的腹泻，部分养猪场采用 猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗进行紧急免疫，但效果甚微。为弄清仔猪病毒性 腹泻在贵州省的流行情况，笔者主要开展了仔猪病毒性腹泻病原快速检测方法的建立、贵州 省仔猪病毒性腹泻流行病学调查及相关基因分析的研究，研究结果为贵州省仔猪病毒性腹泻 的诊断、治疗和疫苗研究提供重要依据。 1．PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 检测方法的建立与临床应用：本研究根据 Genbank 提 供的 PEDV、TGEV 和 RV 基因参考序列，设计三对特异性引物，以 PEDV-TGEV-RV 三联疫 苗 RNA 反转录 cDNA 为模板，分别建立 PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 检测方法，并对其进 行了反应条件的优化。结果显示，PEDV、TGEV 和 RV 扩增长度分别为 651bp、859bp、309bp， 与预期大小相符；PEDV、TGEV 和 RV RT-PCR 反应