固有免疫分泌性蛋白SPLUNC1的鉴定及其参与鼻咽癌细胞凋亡与分化的作用机制研究-病理与病理生理学专业论文.docxVIP

周后德博士学位论文-2005中南大学固有免疫分泌性蛋白SPLUNCI的鉴定及其参与鼻咽癌细胞凋亡与分化的作用机制研究博士研究生：周后德导师：李桂源教授中南大学肿瘤研究所摘要【SPLUN01的克隆及前期研究成果】为寻找在鼻咽组织中特异性表达的鼻咽癌相关基因，我所张必成博士等通过抑制性消减杂交联合cDNA微阵列技术，克隆了鼻咽组织相关的特异性表达基因(nasopharynixassociatedspecificgene，NASG)。后来国外的多个研究所通过二维电泳及基因芯片筛查分离出该基因，由于它与小鼠的上腭、肺及鼻咽上皮克隆(Palate，LungandNasaleDitheliumClone，PLUNC)基因高度同源，在猪、牛、大鼠等物种中都高度保守，分子量小，因而被统一命名为短的PLUNC(ShortPLUNCl，SPLUNCI)基因1。前期的研究发现，SPLUNCI可能在成人的上呼吸道中特异性表达，而且在鼻咽癌细胞株及组织活检标本中表达下调。我所姚开泰院士领导的课题小组对SPLUNCI基因的多态性与鼻咽癌的易感性之间的关系研究进一步发现，SPLUNCl是一个鼻咽癌发生的遗传风险因子。然而，SPLUNCI的功能及具体的作用机制并不清楚，虽然国内外的学者一致推测SPLUNCI可能参与上呼吸道周后德博士学位论文-2005中南大学的固有免疫反应，但这些推测均是基于SPLUNCI的细胞与组织定位而做出的功能假设。然而，在没有对其做出精确的组织定位前，所有功能假设有可能并不成立。因而对SPLUNCI的精细组织定位显得非常迫切。【通过制备SPLUNOl高特异性抗体，对其进行精确的组织学定位并鉴定它为一种分泌性蛋白】要对SPLUNCI蛋白做出精细的组织学定位，首要的是必须制备SPLUNCI的抗体。因此我们通过对SPLUNCI的结构与功能预测，设计并制备了SPLUNCI的高特异性多肽抗体，验证了该抗体能用于免疫组化和westernblot研究。同时，通过免疫组化对人体42种组织的精细定位研究发现，SPLUNCl分布于上呼吸道，眼睛、胃及小肠等与外界环境及有害物质直接接触的部位，表达于这些部位的上皮及粘膜下腺体，在上皮细胞的顶端(顶浆分泌)、浆液腺与睑结膜的睑板腺以及腺导管内表达量最高，暗示着SPLUNCI能分泌到这些与外界环境及有害物质直接接触的上皮表面。为此，我们收集了志愿者的眼泪和唾液，以及门诊体检者的鼻咽分泌物，将它们通过SI)S—PAGE凝胶电泳后进行westernblot分析，结果发现在这些体液中确实存在SPLUNCI蛋白的分泌。并预测SPLUNCI是覆盖在上皮表面的一种天然免疫保护分子。【通过研究SPLUNCI的抗菌与抗EBV，鉴定SPLUNOl蛋白为上皮表面的固有免疫保护分子，并初步证明它具有阻止EBV致瘤的作用】由于上皮表面的天然免疫保护分子常常在对抗感染，清除有害微周后德博士学位论文．2005中南大学生物中发挥重要作用，我们进一步研究了SPLUNCI对上呼吸道常见微生物的作用及其作用机理。保守结构域预测与蛋白三维结构分析发现，SPLUNCI含有一段19个氨基酸的信号肽和一个杀菌／细菌渗透增强蛋白(bactericidal／bacteriapermeabilityincreasingproteinBPI)结构域，其三维结构与细菌渗透增强蛋白及脂多糖结合蛋白相似，表明SPLUNCI可能具有结合细菌脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)，杀灭或抑制革兰氏阴性细菌的功能。于是我们选取了上呼吸道常见的绿脓杆菌，用SPLUNCI对其进行处理，发现SPLUNCI蛋白能明显抑制绿脓杆菌的生长，并通过试验验证了SPLUNCl与细菌脂多糖的结合。从而证明了SPLUNCl清除细菌的功能。由于SPLUNCl在正常鼻咽上皮与腺体中高表达，在鼻咽癌中表达下调并与鼻咽癌的遗传易感性相关，而目前公认的唯一与鼻咽癌相关的致病微生物为EB病毒，因此我们观察了SPLUNCl对EBV的影响。我们发现SPLUNCI能明显的促进EBV感染细胞的凋亡与裂解，同时部分EBV自身也出现明显的结构破损。EBV编码的瘤基因LMPl表达下降，而有利于EBV被机体免疫系统识别的gp350表达则明显增高，这～结果使我们将SPLUNCI的抗微生物作用与抑瘤作用有机的结合起来：当机体SPLUNCl的表达正常时，即使存在EBV的感染，高表达的SPLUNCl也能促使感染细胞的裂解提前，一方面促使髓病毒裂解，表达易被机体免疫系统识别的gp350蛋白，从而启动补体途径和ADCC作用，对EB病毒进行清除；另一方面，SPLUNCl又抑制EB病毒表达LMPl，使其致瘤的能力降低。周后德博士学位论文-2005中南大学【首次在鼻咽癌组织中发现了能引起细胞线粒体水肿的纳米细菌，证明了SPL