含xv类半胱氨酸骨架的芋螺毒素家族的发现、进化分析和功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中山大学硕士学位论文摘 中山大学硕士学位论文 摘 要 芋螺是生活在热带海域浅水区的肉食性的海洋软体动物。它们利用毒液中鸡尾 酒样的混合毒素(芋螺毒素)捕食、防御和竞争。芋螺毒素能特异地作用于神经系 统的电压门控和配体门控离子通道的不同亚型和递质受体，因而被广泛用作神经生 物学研究的离子通道和受体研究工具药物，有些被直接开发成临床药物和诊断试 剂。 芋螺毒素虽然高度变异，种类繁多，但是到目前为止，它们共用非常有限的14 种半胱氨酸骨架。我们从中国南海食虫芋螺信号芋螺(C．1itterarus)毒管cDNA表 达文库EST序列分析中发现一个编码典型芋螺毒素前体肽结构的cDNA序列，成熟 肽区含有8个半胱氨酸，且排布方式不同于已经发表的任何一类半胱氨酸骨架，根 据现有的芋螺毒素命名原则，我们将这一种新类型的骨架命名为骨架XV，该新的 芋螺毒素被命名为Ltl5．1。根据Ltl5．1的前体肽编码序列设计引物从另外两个食虫 芋螺物种C．betulinus和C．emaciatus毒管cDNA一链中克隆到与Ltl5．1属于同家族 的两个序列Btl5．1和Ecl5．1，从而证实了一个新的芋螺毒素半胱氨酸骨架XV (．C．C．CC C C C．C．)在芋螺中的广泛存在。 对GenBank公共数据库进行Blast同源序列搜索发现XV类芋螺毒素的信号肽 部分与四环芋螺毒素(现在定义的O超家族)中的MEKL家族具有很高的相似性， 采用RT-PCR的方法从发现Ltl5．1序列的信号芋螺中分离到两个MEKL家族成员 Lt7．1和Lt7．2。利用GenBank中的四环毒素序列，综合我们克隆到的三个XV类骨 架芋螺毒素和MEKL家族成员Lt7．1和Lt7．2前体肽序列进行进化树分析。进化树 结果表明四环毒素聚成三个大类，XV类芋螺毒素与MEKL家族聚在一个大支，显 示XV类芋螺毒素与MEKL家族之间存在较近亲缘关系，而与四环芋螺毒素其他三 个家族进化距离较远。 取Ltl5．1、Btl5．1和Ecl5．1成熟肽构建了硫氧还蛋白(TIⅨ)融合表达载体， 在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了原核表达。以0．ImMIPTG做诱导剂1812过夜诱导 表达12小时成功获得了三种可溶的重组融合蛋白rTRX．1t15a，rWRX．btl5a和 ITRX．ecl5a。采用Ni2+螯和亲和层析对三种融合蛋白进行了初步纯化，获得了约90 ％纯度的重组融合蛋白。亲和层析纯化后的rTRX．1t15a再经过弱阴离子交换层析 含XV类半胱氨酸骨架芋螺毒素的发现、进化分析和功能研究(DEAE 含XV类半胱氨酸骨架芋螺毒素的发现、进化分析和功能研究 (DEAE sepharose ion exchange FF)纯化后获得了电泳单一条带的融合蛋白。 rTRX．1t15a经3C酶切后采用Sephadex G．50进一步纯化获得了酶切后的目的蛋白 rltl5a，经电喷雾电离质谱(ESI．MS)鉴定，分子量与理论计算值4413．0D相符合。 采用全细胞膜片钳记录模式研究了rltl5a对急性分离大鼠背根神经节(DRG) 神经元上的钠电流的影响。结果表明4ltM的毒素浓度与细胞孵育15min能抑制72 ％钠离子峰值电流。电流．电压曲线表明rltl5a不能改变钠通道的激活电压，但能降 低通道的峰值电流和翻转电位。rltl5a作用时程曲线表明随着时间的延长，抑制程 度越来越高，呈时间依赖性质。进一步对rltl5a作用的浓度．反应研究表明，毒素的 抑制作用呈浓度依赖性。 本研究在基因水平上确立了一个含XV类半胱氨酸的芋螺毒素新家族，进化分 析表明与四环芋螺毒素的MEKL家族有进化亲缘关系。新家族的三个成员成功的原 核重组表达、纯化为下游的功能鉴定、作用机理以及构效关系研究等工作奠定了良 好的基础。rltl5a对钠离子通道的抑制作用研究为探明这个新家族的功能奠定了基 础。 关键词： 芋螺，芋螺毒素，XV类半胱氨酸骨架，进化分析，融合表达，膜片钳， 钠离子通道 Il 中山大学硕士学位论文Abstract 中山大学硕士学位论文 Abstract Cone snails(Genus COnlVS)are predatory marine mollusks found in all tropical mal ine habitats．All members use venom containing a cocktail mixture of peptide toxins(conotoxins)to capture prey，defend against predator and compete with other organisms．Conotoxins are neuropharmacologically acti