海洋酒精酵母的筛选及酒精酵母菌W0的遗传改造-微生物学专业论文.docxVIP

海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母茵WO的遗传改造学位论文完成日期： 海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母茵WO的遗传改造 学位论文完成日期： 加，}、岁．：》I 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 学位论文作者签名：拯靳覆篓字日期：如7／年妇害／日学位论文版权使用授权书 学位论文作者签名：拯靳覆篓字日期：如7／年妇害／日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公 学位论文作者签名：超粮 导师签字：铲叭／ 众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签字日期：刎年夕月引日 签字日期：矽f阵f月岁。日 海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母菌W0的遗传改造海洋酒精酵母菌的筛选和酒精酵母菌W0的遗传改造 海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母菌W0的遗传改造 海洋酒精酵母菌的筛选和酒精酵母菌W0的遗传改造 摘 要 随着地球上化石能源的日趋枯竭和环境保护意识的不断加强，用燃料酒精取 代部分汽油已经成为一项重要的策略。目前，酒精的生产主要是通过酒精酵母对 淀粉质或糖质原料的发酵来实现。酒精酵母最终的酒精产量受多种因素复杂调 控，最显著的是发酵过程中高浓度酒精对细胞的毒害作用。在发酵过程中，随着 发酵液中酒精浓度的增加，乙醇破坏细胞膜，损坏功能蛋白，逐渐导致酒精酵母 菌的死亡。 海洋覆盖率占地球面积的71％，是个巨大的宝库。海洋环境物种丰富，有许 多我们未发现但是可以利用提高人们生活质量的物种，合理开发利用海洋资源已 经被各个国家提上日程。我们实验室从中国沿海采样得到1000多株海洋酵母菌， 经过生理生化实验及分子生物学鉴定，只有17株是酒精酵母菌。这17株酒精酵 母菌主要分布在渤海、东海和南海，而采自黄海的样品中没有发现。其中5株产 酒精能力较强，为Saccharomyces cerevisiaes 2E00400、2E00498、2E00558、 2E00723、2E00724，这5株菌都是采自渤海。这种特殊的地域分布目前还没有 合理的解释。在实验中发现，这些酒精酵母中，分离自渤海的菌株产酒精能力比 其它地域的菌株强，而所有分离白海洋环境中的酒精酵母菌其发酵能力都不如高 产酒精的对照菌株酒精酵母菌(Saccharomyces sp．)W0强。 环境胁迫下酒精酵母的耐受能力是考验一株酒精酵母能否作为工业菌种是 否成熟的重要标志，同时选育耐性酵母菌株提高发酵能力也是当前的研究热点之 一。本实验通过与菌种库中产酒精能力较高的菌株相比，发现产酒精能力最高的 Saccharomyces sp．W0并不是耐受酒精能力最强的菌株，在18％(v／v)的酒精环 境下培养2h后，W0菌株只有39％的生存率，而相同条件下2E00498菌株则可 以达51％的生存率。由于酵母菌的耐酒精能力和细胞内产生的海藻糖的量有直接 关系，我们测定了产酒精能力较高的酒精酵母菌株的海藻糖产量，发现W0菌株 的海藻糖含量比2E00498菌株少3 1．5％。 本实验室扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)Al l能够产生24．8％ 海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母菌W0的遗传改造(w／w)海藻糖，分泌高含量的蛋白酶，意味着这株菌能够有很高的海藻糖合成 海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母菌W0的遗传改造 (w／w)海藻糖，分泌高含量的蛋白酶，意味着这株菌能够有很高的海藻糖合成 酶活性。而扣囊复膜酵母和酒精酵母的海藻糖合成途径是一样的，我们克隆出 S．fibuligeraAll中海藻糖合成酶的编码基因盱峪7，构建了表达载体pMIRSCl l一 砰塔』，经NotI线性化酶切后转化进Saccharomyces sp．W0的尿嘧啶缺陷型菌株 W12d中，得到重组子Saccharomyces sp．Z8。经过测定，我们发现重组子相对于 W0来说，产酒精能力和耐酒精能力都有了提高。产海藻糖最高的重组菌株z8， 它的海藻糖含量比对照菌株W0高出近30％，海藻糖合成酶活力比WO菌株高 33％。每克细胞的发酵能力方面Z8菌株最终减重达到36(g／g)，而WO菌株只有 27(g／g)。发酵过程中每天测定平行样中海藻糖的含量，发现WO菌株比Z8菌株 要低，这可能和Z8菌株的产酒精能力更强一些有关。对两者进行高浓度酒精的 冲击试验，重组子Z8在18％(v／v)高浓度酒精中经3ll培养后有25．14％的存活 率，而对照菌株WO只有12．09