第三章-细胞生物学研究方法(1).pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法 教学目的 1 了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用；2 认识工具和方法与学科发展的相关性。教学重点 1 仪器、方法的基本原理和基本应用 2 细胞培养与细胞工程教学难点 细胞组分的分析方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 n Sinα的量称为物镜的数值孔径(numeric aperture)，缩写为NA 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点： 光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 原理 用途：观察未经染色的玻片标本 （六）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 （七）当代显微镜的发展趋势 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 1. 原理 表二、不同光线的波长 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 3）冰冻蚀刻 freeze-etching （二）扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 （三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 一、离心技术 （一）差速离心 Differential centrifugation 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心 1、速度沉降 velocity sedimentation 2.等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 特点： 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往