肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建及对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响-生物学;细胞生物学专业论文.docxVIP

Classified Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)：no NO．：120910796 Dissertation for the Master Degree The Construction of Muscle-·Specific Promoter IGF2 Expression Vector and Its Impact on Bovine Skeletal Muscle Satellite C ells Proliferation Candidate：Sun Xiaoli Supervisor：Professor Yan Yunqin Degree Category：Master of Science College：C01lege of Life Science First level discipline：B iology Second level discipline：Cell B iology Harbin China June 2015 万方数据 ||Ul ||Ul I I I U Ul II I I lU III Y2771 583 目 录 摘要 I 英文摘要 ．．III l引言 1 1．1 IGFS家族简介 ．．1 1．2 IGF2基因的研究进展 1 1．2．1 IGF2基因的结构 一1 1．2．2 IGF2基因的功能 ．．1 1．2．3 IGF2基因信号通路 ．．2 1．3启动子的结构与功能概述 4 1．4组织特异性启动子概况 4 1．4．1组织特异性启动子研究进展 ．．4 1．4．2肌肉特异性启动子CMV-MyoGpro概况 一5 1．4．3肌肉特异性启动子MyoGpro—double概况 5 1．4．4肌肉特异性启动子Desminpro概况 ．．6 1．5研究的目的及意义 6 2材料与方法 ．8 2．1主要实验材料 8 2．1．1菌株、质粒及细胞 8 2．1．2工具酶、试剂盒和其他试剂 8 2．1．3主要仪器 9 2．1．4主要试剂的配制 9 2．2实验方法 ．．10 2．2．1细胞的培养 ．．10 2．2．2牛IGF2基因的克隆 12 2．2．3肌肉特异性启动子IGF2表达载体的构建 15 2．2．4重组质粒瞬时转染牛骨骼肌卫星细胞和牛胎儿成纤维细胞 16 2．2．5 EDU检测重组质粒对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响 17 2．2．6 RT-PCR检测三种重组质粒转染细胞后相关基因的表达变化 18 2．2．7 Western Blot检测转染后相关基因蛋白的表达变化 20 3结果与分析 23 3．1肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建 23 3．1．1牛IGF2基因CDS区的克隆与测序 23 3．1．2中间载体pcDNA3．1(+)．IGF2酶切鉴定 25 3．1．3肌肉特异性IGF2表达载体的构建及双酶切鉴定 ．．26 3．2表达载体活性与特异性的筛选 ．．29 I 万方数据 东北农业大学理学硕士学位论文3．2．1 东北农业大学理学硕士学位论文 3．2．1 RT-PCR检测三种重组质粒转染细胞后IGF2的表达变化 ．29 3．3真核表达载体pGL3．desminpro—IGF2对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响 ．．30 3．3．1 EdU检测转染pGL3．desminpro．IGF2后对细胞增殖的影响 ．．30 3．3．2 RT-PCR检测转染pGL3．desminpm．IGF2后细胞周期相关基因的表达变化 32 3．3．3 Western Blot检测下游基因AKT和P．AKT蛋白的表达 33 4讨{仑 ．34 4．1载体的选择 ．．34 4．2组织特异性启动子功能的研究 ．．34 4．3转染方法及条件的选择 ．．35 5结论 ．37 致谢 ．38 参考文献 ．．39 攻读硕士学位期间发表的学术论文 ．．44 II 万方数据 CONTENTSCoNTENTS CONTENTS CoNTENTS Abstract in Chinese ·· “I Abstract in English III 1 IntrOduction ．1 1．1 Intoduction ofIGFS family ·1 1．2 Progress IGF2 gene． ．．．． ·- 1 1．2．1 Structure oflGF2 gene ． ． ·1 1．2．2 Function ofIGF2 gene ．．． 1 1．2．3 Signaling pathway ofIGF2 gene Z 1．3 Profiles ofstructure and fuction ofpromoter ·4