免疫沉淀技术.ppt

基本流程 三．酶免疫定位 封闭： 抗体的的选择：来源、标记、效价、二抗 标记的选择：HRP、AP 技术优势 灵敏度高 特异性高 方法简便 无需纯化 易于观察、保存 应用范围 蛋白质相对含量检测 蛋白质修饰水平分析 蛋白质相互作用研究 指一个抗原分子上能与相应抗体分子结合的抗原决定基的总数。 * 抗原异质性：指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子。 * 当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素。 * 即在待测样本中游离的半抗原分子会竞争抑制反应体系中载体偶联后的半抗原与抗体形成复合物，从而使速率散射峰值降低。 * 1.表位的位置、结构以及蛋白质相互作用的影响 2.缓冲液、去污剂配方 * 蛋白复合物的完整性，复合物对表位的影响 * 蛋白质-DNA复合物的维持 * 免疫比浊法的分类 （1）透射比浊法（transmission turbidimetry） （2）散射比浊法（nephelometry） （3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatex turbidimetry） （4）速率抑制免疫比浊法（rate inhibition immunoturbidimetry） 免疫沉淀技术（Immunoprecipitation assay） 关键因素 抗原的丰度 抗体的结合能力 蛋白和抗体的可接触性 应用范围 免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation assay） 结果分析 Nat Immunol. 2008 Apr;9(4):369-77. GST PULL DOWN 结果分析 PNAS February 26, 2008 vol. 105 no. 8 2836-2841 应用范围 寻找新的相互作用蛋白 验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用 免疫共沉淀的局限性 （1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用 （2）不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用 （3）灵敏度不如亲和色谱高 （4）需对未知蛋白的相关信息有一定了解 基因转录调控 染色质免疫共沉淀 染色质免疫共沉淀 结果分析 Mol Cancer Ther June 2010 vol. 9 no. 6 1764-1774 RNA免疫沉淀 在生理状态下对结合在RNA上的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA的含量。 应用范围 研究蛋白与DNA的动态作用 研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的关系 研究蛋白与RNA的相互作用 免疫沉淀中抗体的选择 免疫共沉淀技术的应用 凝胶中沉淀反应 以一定浓度（1～2%）的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自由扩散，形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇且比例适当时，在相应位置即可出现可见的沉淀环或沉淀线。 沉淀线特点 形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀 与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自由通过 沉淀线的位置与抗原抗体的浓度和迁移率有直接关系 单相免疫扩散试验（single immunodiffusion） 双向免疫扩散试验（double immunodiffusion） 沉淀线分析 A B C D E F Ag Ab 沉淀线分析 免疫电泳（immunoelectrophoresis） 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis） 火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis） 交叉免疫电泳（crossed immunoelectrophoresis） 免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis） 首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，抗体与对应的抗原就会直接结合，形成的复合物嵌于固相支持物中。 Urine Immunofixation Electrophoresis 免疫印迹技术（immunoblotting） 基本流程 一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 1. 收集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药物处理细胞 2. 蛋白质浓度测定：BCA 3. 电泳：10％分离胶、4％的浓缩胶 4. 电泳结果检查 二. 电转移 毛细管印迹法和电泳印迹法 转移膜的选择 ? NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 结合能力 80－110 ug/cm2 400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合） 材料质地