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上海交通大学学位论文版权使用授权书
上海交通大学
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剿位 论 姓作 者 签 名 锣 秀 指导教师躲铉裹痞彳
醐玑 如 旷年 芦 月 以 日期: 年 月 日
上海交通大学博i。学位论文
上海交通大学博i。学位论文 基于转录和翻译双调控的靶向性肿瘤基因治疗 摘要
恶性肿瘤的基因治疗在实验中已经取得了非常大的突破,但是在临床应用上 始终难以被接受和推广。作为一种治疗方案,有效性和安全性同样重要。目前众 多的基因治疗方案对抑制肿瘤细胞生长都非常有效,但同时也会伤及正常细胞。 靶向性差已成为恶性肿瘤基因治疗发展过程中的一大瓶颈。靶向性的含义包括治 疗基因转移靶向性和表达靶向性两个方面。治疗基因的表达又可以在基因活化、 转录、转录后、翻译和翻译后等多个层面上得到调控。
人端粒酶逆转录酶启动子(human_telomerase reverse transcriptase卫romoter, hTRTP)因其具有肿瘤特异的转录特性而倍受关注,但是它的转录活性还有待提 高。本研究通过人工改造hTRTP以期获得高效及高特异性的hTRTP优化形式。 人缺氧诱导因子-l(_hypoxia-_inducible_factor-1,HIF.1)是一种在缺氧的肿瘤细胞 内富集的转录因子。其a亚基一HIF.1 a肽链中部的氧依赖降解结构域 (oxygen-dependent degradation domain,ODD domain)能感受细胞内氧分压进而 调节HIF-1的稳定性。我们通过将肿瘤抑制基因(human盥邋一domain containing
o_.Kxidoreductase,hWWOX)与HIF ODD结构域序列连接,构建融合蛋白 hWWOX’一linker-HIF ODD,希望该融合蛋白在保持原肿瘤抑制功能的同时带有 氧依赖降解特性,达到在常氧的正常细胞内快速降解,而专一地在缺氧的肿瘤细 胞内稳定存在,发挥杀伤作用的耳的。在优化的hTRTP的转录调控和融合蛋白 hWWOX、.1inker-HIF ODD的翻译后调控下,尝试一种肿瘤基因治疗的双调控策 略。实验包括以下三部分内容: 一.人端粒酶逆转录酶启动子(hTRTP)的转录活性改造
用PCR方法从pGL3.Basic.TRTP207载体上扩增230bp的hTRTP230,该片
段中含有与bTRTp的转录活性密切相关的“E.box--5×GC.box~E.box”序列, 按不同拷贝数插入pGL3.Basic—TRTP207后,构建pGL3-Basic.TRTP207.2和 pGL3.Basic.TRTP207.3。同时扩增23Top的hTRTP230一TATA,同样插入
L海交通人学博。L学位论文pGL3-Basic—TRTP207后,构建pGL3-Basic.TRTP207-TATA。将以上四种报告基因
L海交通人学博。L学位论文
pGL3-Basic—TRTP207后,构建pGL3-Basic.TRTP207-TATA。将以上四种报告基因 载体(pGL3-Basie-TRTP207、pGL3-Basic-TRTP207—2、pGL3一Basic-TRTP207.3和 pGL3-Basic—TRTP207-TATA)瞬时转染肿瘤细胞A549、Hela、HepG2、Hep3B及 J下常细胞WI.38,荧光素酶活性检测显示:构建的三种hTRTP新形式(TRTP207.2、
TRTP207.3和TRTP207.1:觚A)的转录活性均有不同程度提高,其中TRTP207—3 活性最高。TRTP207-2和TRTP207-3在转录活性提高的同时仍然保留了肿瘤专 一的转录特性;而TRTP207.TATA丧失了转录特异性,在正常细胞WI.38中强 烈驱动荧光素酶表达。故TRTP207.3可以用作下一步实验。
二.含有HIF ODD结构域的融合蛋白的构建及其氧依赖降解特性的研究
用PCR方法克隆了HIF-l o的HIF ODD结构域,将其融合至两种报告基因 EGFP和luc的羧基端。构建的融合蛋白EGFP’.1inker-HIF oDD和luc‘-linker-HIF ODD在常氧环境下能迅速降解;在l%02环境中稳定存在。在此预实验基础上 构建了表达载体pcDNA3 o—hWWOX’.1in
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