基质金属蛋白酶及其抑制剂与角膜新生血管形成的实验研究-眼科学专业论文.docx

华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 200I级|肆士学位论文 基质金属蛋白酶及其抑制剂与角膜新生 血管形成的实验研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科 博士研究生 袁静 博士生导师 胡燕华教授 前言 角膜组织无血管和淋巴管，在某些病理状态下，如炎症、感 染、变性、创伤等，伴随角膜新生血管。角膜新生血管不仅使角 膜失透明，还易使角膜移植术后发生排斥反应。新生血管形残是 一个复杂的病理过程，涉及到内皮细胞增殖、迁移，基底膜及细 胞外基质的降解等．其中基底膜和细胞外基质的降解是血管形成 的关键一步。研究表明：有图种蛋白水解酶在细胞外基质(ECM) 降解中起作用，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺 蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMPs)。MMPs作为四种主要的蛋白 水解酶之～，在癌症进展中有重要作用。MMPs是一组锌离子依 赖酶，迄今己发现有26个成员，构成MMPs超家族。根据其作用 底物的不同而分为5类。其中MMP．1为间质胶原酶，可降解I、 II、 型胶原和纤维胶原；MMP．2为明胶酶B．可降解IV、V型 胶原及明胶等；MMP．3为基质溶素．1，可降解蛋白多糖、纤维连 华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 2001级博士学位论文 接蛋白、层粘连蛋白、Iv、X型胶原等。MMPs的主要作用是降解 基质蛋白，在ECM代谢的调节中起着非常重要的作用．因角膜 ECM主要由三种大分子构成：胶原(包括J、叭Vl、V型胶原)、 蛋白多糖、糖蛋白，故上述三种MMPs与角膜新生血管的形成关 系密切。TFPI．2是新近发现的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，体外可 抑制包括纤溶酶、胰蛋自酶、金属蛋白酶在内的多种蛋白酶，在 维持细胞外基质结构的完整性以及调控肿瘤细胞的侵袭转移等方 面起着重要作用，与只有胶原酶抑制作用的金属蛋白酶抑制物 TIMP相比，TFPf一2的蛋白酶抑制谱更广，抑制麓力更强。 以往的研究表明：1，MMPs表达异常在角膜新生血管形成中起 着重要作用：2．抑制MMPs的活性可有效抑制新生血管生成； 3．TFPI．2基因分布广泛，在人类肝、肾、心、骨骼肌和胰腺等组 织中均有表达：4．TFPI，2广谱的丝氨酸蛋白酶抑制作用。 基于以上四点，我们考虑：1．作为角膜炎症的主要靶细胞一基 质细胞表达iMPs及在炎性介质刺激下表达MMPs的情况如何： 2．基质细胞是否表达TFPI一2蛋白，若表达，它对角膜基质细胞表 达MMPs是否有调控，对角膜新生血管生成是否有抑制作用，其 程度如何?本研究从基质细胞原代及传代培养、细胞转染和实验 动物模型三方面研究MMPs及其抑制剂与角膜的关系，以求为角 膜新生血管的基因治疗提供新的靶点， 第一部分：体外培养兔角膜基质细胞其基质金属蛋白酶 的表达及调节 摘要：目的观察培养的兔角膜基质细胞iMPs的表达及在炎性介 华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 200l级博士学位论文 质下表达的变化。方法兔角膜基质细胞原代及传代培养：免疫荧 光染色观察传4代培养角膜基质细胞，分别经0，5。10，20rag．L。 LPS作用24小时，表达MMP．1的强度变化：Western Blot方法 检测原代及传4代细胞经和不经10mg，L。LPS作用48小时后， 其MMP^3．2的蛋白表达情况：RT_PCR方法检测传4代细胞经 和不经10mg．L4 LPS分剐作用6．12，24，48小时后，其MMP_1 3．2mRNA的表达情况。结果原代角膜基质细胞几乎不表达 MMPl，3，传代细胞MMPl，3表达升高，LPS可开启和上调原 代及传代细胞表达MMPl，3：MMP2无论在原代或传代细胞均持 续表达，LPS可上调原代细胞表达MMP一2，但下调传代细胞 MMP．2的表达：LPS作用下MMPsmRNA的表达呈动态变化。结 论角膜炎症反应中，炎症介质可调节基质细胞表达MMPs，可能 是炎性角膜新生血管产生的一种重要调控因素。 关键词：角膜基质细胞：基质金属蛋白酶：免疫荧光法；Western blot：RT．PCR． 第二部分：转TFPI．2基因兔角膜基质细胞基质金属蛋白 酶的表达 摘要：背景及目的组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2．TFPI．2)是一种新近发现的丝氨酸蛋白酶抑制物，在维 持细胞外基质完整性和抑制肿瘤转移、浸润有重要的作用。本研 究旨在探讨角膜基质细胞TFPI．2的表达及转染前后基质细胞表达 基质金属蛋白酶的变化情况，为角膜新生血管的基因治疗提供方 法。方法体外兔角膜基质细胞原代、传代培养：脂质体介导人类 华中科技大学