课件：第一章第五节蛋白质的结构与功能的关系.ppt

2、密度梯度（区带）离心 60000~80000转/分 重力60万～80万倍 3、凝胶过滤 （二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜 原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 (三) 利用电荷差别纯化的方法 几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 等电聚焦电泳 等电聚焦 双向电泳 双向电泳 离子交换层析 离子交换层析 （四）利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 （五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 （一）测定蛋白质总量 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、BCA 法（4,4’-二羧-2,2’-二喹啉 bicinchoninic acid） 5、Bradford法 6、胶体金法 7、紫外吸收法 物理性质 化学性质 （二）测定蛋白质混合物中某一特定 蛋白质的含量 （三）鉴定蛋白质制品的纯度 1.电泳分析 2.沉淀分析 3.扩散分析 第七节 蛋白质测序 （1）英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。 （2）建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（ 20世纪50年代）。 （3）Edman降解（20世纪70年代出现）。 仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。 进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。 （4）20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂－DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。 蛋白质测序的发展： （5）对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。 （6）毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。 （7）蛋白质C端测序：C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。 ① 最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。 ② 直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定。 （8） 质谱法用于蛋白质顺序测定： ① 必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。 ② 20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子、离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定得以实现。 ③ 20世纪80年代末出现了电喷雾质谱和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱。 电喷雾质谱测定分子量数万的蛋白质准确度可达万分之一，主要优点是可与HPLC仪实现液质联用，因而能使一个蛋白质的酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。 飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质C端与N端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微（1-2pmol），且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。 （9）质谱技术不能完全取代Edman降解与其他蛋白质分析方法。通常是联合运用这些技术。 （10）蛋白质测序展望： ①N