环氧烷胺衍生物修饰siRNA负载脂质体的肺部给药研究-药剂学专业论文.docxVIP

环氧烷胺衍生物修饰 siRNA 负载脂质体的肺部给药研究 中文摘要 环氧烷胺衍生物修饰 siRNA 负载脂质体的肺部给药研究 中文摘要 目的：制备负载 Survivin siRNA、MRP1 siRNA 的新型类脂质体用于肺部给药， 与抗癌药物顺铂联用逆转肿瘤耐药性，考察该给药系统对于 siRNA 的递送能力。 方法：合成三种具有不同碳链长度和氨基结构的环氧烷胺衍生物 EAADs（Epoxy Alkyl Amine Derivative Lipidoids，EAADs），采用 1H-NMR、FT-IR 进行结构表征。采 用乙醇注入法制备 EAADs、PEG-EAADs 和 EGFR mAb-PEG-EAADs 类脂质体，通过 流式细胞仪和共聚焦显微镜观察其在 A549/DDP 细胞中的摄取和分布情况，喷雾冷冻 干燥法制备成干粉吸入剂。以顺铂为抗癌药物，采用负载 Survivin siRNA 和 MRP1 siRNA 的 EAADs 类脂质体转染 A549/DDP 细胞后，MTT 法检测该细胞对顺铂的敏感 性，Western Blot 法检测 Survivin 蛋白和 MRP1 蛋白表达情况，Annexin V-FITC/PI 双 染法和碘化丙啶（PI）法分别检测 A549/DDP 细胞给予 Survivin siRNA 后的凋亡及周 期变化情况。采用 IVIS Lumina Ⅱ小动物活体成像仪观察静脉注射和肺部吸入给药时 负载 Cy5-siRNA 的 EAADs 类脂质体在裸鼠体内的分布情况。在 Luci-A549 原位肺癌 模型上通过小动物活体成像仪监测肿瘤生长情况以考察负载 Survivin siRNA 和 MRP1 siRNA 的 EGFR mAb-PEG-EAADs 类脂质体与顺铂联用时在裸鼠身上的抗肿瘤效果。 最后进行相关指标的血液生化学分析以及对肺组织 HE 染色进行病理观察。 结果：EAADs 类脂质体外形圆整、粒径在 200 nm 左右，载体安全性良好，对 siRNA 具有较好的保护作用，满足给药需求。喷雾冷冻干燥法制得的干粉吸入剂物理粒径为 11.90±0.57 μm、空气动力学粒径为 2.45 μm、引湿性为 6.64±1.12%。该法制得的干 粉具有多孔低密度特征，空气动力学粒径符合肺部给药要求。EAADs-3 类脂质体在 A549/DDP 细胞上的摄取明显高与 EAADs-1 和 EAADs-2 类脂质体，PEG 修饰后摄取 率增加，且 EGFR mAb-PEG-EAADs-3 类脂质体更倾向于定位在 A549/DDP 细胞的细 胞质中。EGFR mAb-PEG-EAADs-3 类脂质体在 A549/DDP-Raw264.7 共培养体系中主 要能够选择性的进入 A549/DDP 细胞。通过 Western Blot 法筛选出高沉默效率的 Survivin siRNA 序列和 MRP1 siRNA 序列，以 EAADs-3、PEG-EAADs-3 和 EGFR mAb- PEG-EAADs-3 类脂质体作为转染试剂将 Survivin siRNA（或 MRP1 siRNA）转染进 A549/DDP 细胞后，A549/DDP 细胞对顺铂的敏感性提高，相应蛋白的表达量下降， I II II 中文摘要 环氧烷胺衍生物修饰 siRNA 负载脂质体的肺部给药研究 此外转染 Survivin siRNA 后的细胞凋亡率上升，G2 期延长。体内分布结果显示雾化 吸入以及干粉吸入 EAADs 类脂质体相对于静脉注射给药能延长药物在肺部的滞留时 间。体内抗肿瘤结果显示联合使用 Survivin siRNA、MRP1 siRNA 和 DDP 组肿瘤抑制 要强于单独使用 DDP 组，肝肾功能没有明显损伤。 结论：EGFR mAb-PEG-EAADs-3 类脂质体具有良好的递送基因药物的潜力，有 望通过肺部给药给予相关 siRNA，逆转肿瘤耐药性，增强顺铂的治疗效果。 关键词：EAADs；肺部给药；Survivin siRNA；MRP1 siRNA；A549/DDP 作 者：陈 琴 指导教师：崔京浩 PAGE PAGE IV A siRNA Loaded Epoxy Alkyl Amine Derivative Lipoplex for Pulmonary Administration Abstract A siRNA Loaded Epoxy Alkyl Amine Derivative Lipoplex for Pulmonary Administration Abstract Objectives: To reduce the resistance of c