生物物理技 术-1科目讲解.pptVIP

四、荧光生色团的结构特点 1、天然荧光生色团的结构特点 （1）碳原子骨架： 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高 荧光效率。 例如：对苯基化，间苯基化等。 （2）分子的几何排布： 具有刚性平面结构 荧光素 酚酞 （4）取代基的位置： 邻位、对位—荧光增强，间位—荧光减弱（-CN基例 外） （5）环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光 （3）取代基的类型： 1）加强荧光的基团：给电子取代基， -NH2, -NHR, -OH,-OR, -CN,-OCH3,-OC2H5 2）减弱荧光的基团：得电子取代基， -CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I 3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH3 2、蛋白质和核酸中的荧光生色团 色氨酸Tryptophan (W, Trp) 苯丙氨酸Phenylalanine (F, Phe) 酪氨酸Tyrosine (Y, Tyr) 四、荧光生色团的结构特点 生色团 条件 ?ex nm ?max 10-3 ?em nm ?F ?F ns 敏感度?max?F 10-2 Trp H2O, pH7 280 5.6 348 0.2 2.6 11 Tyr H2O, pH7 274 1.4 303 0.1 3.6 1.4 Phe H2O, pH7 257 0.2 282 0.04 6.4 0.08 Y-base 二氢尿嘧啶 Yeast t-RNAPhe 320 1.3 460 0.07 6.3 0.91 亚硝基奈酚+Tyr 茚三酮（Cu2+ pH5.8)+Phe ?ex: 460nm, ?em: 570nm ?ex: 365nm, ?em: 515nm 五、影响荧光测量的因素 1、光分解（photodissociation） 光照后导致化学键断裂——荧光减弱 光漂白 2、淬灭(quenching) (1)温度淬灭： 温度每升高10C ，荧光减少的百分比，称为温度系数。 在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。 (2)浓度淬灭：内滤光效应（inner filter effect) (3)杂质淬灭：3O2 1O2 3、溶液pH的影响 利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变， 可以判别各种滴定的终点。 指示剂 颜色变化 pH范围 萘 酚 无色变黄绿 8.2-10.3 荧光素 浅绿变绿 4.0-5.0 丫啶橙 浅黄绿变黄 8.0-10.0 4、溶液极性的影响 荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向 （或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。 ＤＰＨ(膜探针)：１，６－二苯基－１，３，５－己三烯 水溶液中 膜 中 发射波长：440nm 发射波长：430nm 5、溶剂和化学试剂 (1) 溶剂选择要适宜 例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。 (2) 溶剂要纯 6、荧光污染 (1) 涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞 (2) 去污剂 (3) 微生物污染 (4) 滤纸 六、荧光光谱技术的应用 (一) 物质的检测 1、测量原理： 稀溶液， F= ? I0εcL 2、结构特点：含有“芳香环”结构 3、灵敏度：10-7~10-8g/ml 检测物质 激发波长nm 发射波长 nm 维生素A 345 490 维生素B2，pH7 370 565 维生素B12， pH7 275 305 维生素C 490 530 3,4-苯并芘10-6g/ml 381 403 5-羟色胺，中性或弱酸性 295 330 5-羟色胺，盐酸 295 550，330 研究生物大分子构象 （二）蛋白质的荧光分析 1、蛋白质的内源荧光 2、蛋白质的外源荧光 （1-苯胺基萘-8-磺酸盐） ◆ GdnHCl盐酸胍 （三）核酸的荧光分析 1、嘌呤及衍生物 室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。 　　　　　　　　　　　　　酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。 　　　　　　　　　　　　　碱性介质中，鸟嘌呤有荧光 2、嘧啶及衍生物 游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低Φ＝0.0015 3、核酸的荧光标记 Probes ?ex ?em Note