鸡CD8a基因的克隆,原核表达及单克隆抗体的制备-微生物学专业论文.docxVIP

I I 摘要 CD8分子是T淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴细胞表面重要的 标志性分子之一。不同于单链形式的CD4分子，CD8分子是二聚体，并且有αα同 型二聚体和αβ异型二聚体两种表达形式。鸡CD8分子主要表达于细胞毒性T淋巴 细胞、抑制性T细胞和树突状细胞的表面。其中，CD8αα同型二聚体一般表达于 外周CD4+T淋巴细胞，而CD8αβ异型二聚体仅表达于细胞毒性T淋巴细胞。CD4 主要识别MHCⅡ类分子递呈的外源性抗原；而CD8主要识别MHCⅠ类分子递呈 的内源性抗原，同时，CD8与MHCⅠ类分子的相互作用能够显著增强MHC分子 与TCR之间的亲和力。距今为止，普遍公认CD8分子具有辅受体功能，辅助TCR 的信号传递。最近的研究表明，CD8αα分子还可以作为辅阻遏物，调节TCR的活 性。鸡CD8分子是鸡免疫系统的重要组成部分，与哺乳动物的CD8分子在生物进 化和功能上有明显的相似性，显然，CD8分子与鸡的免疫防御系统密切相关。 首先参照 NCBI 数据库中登陆的鸡 CD8α、CD8β cDNA 序列，应用软件 Primer Premier 5.0 分析鸡 CD8α、CD8β基因完整序列，设计两对引物。通过 RT-PCR 技 术，从鸡胸腺组织总 RNA 中分别扩增出两条特异性基因片段，经测序鉴定，与 NCBI 数据库中已有的鸡的 CD8α和 CD8β基因序列同源性均超过 98%。PCR 产物 分离纯化后连接到 pMD18-T 载体，经菌液 PCR 筛选出阳性重组克隆后进行序列 测定。结果表明本实验成功的克隆到鸡 CD8α和 CD8β基因，两者分别由 710 和 711 个核苷酸组成。 根据本实验测定的鸡 CD8α基因序列和原核表达载体 pET-32a 的多克隆酶切 位点序列设计两对引物，应用 PCR 技术从重组质粒 pMD18-T-CD8α中扩增出编 码鸡 CD8α分子膜外区的基因片段，基因片段长为 510bp。PCR 产物分离纯化后 连接到原核表达载体 pET-32a 的多克隆酶切位点，经菌液 PCR 和 EcoRⅠ、Sal Ⅰ双酶切鉴定，筛选出阳性重组克隆，构建成 CD8α基因膜外片段的原核表达质 粒 pET-32a-CD8α。将 pET-32a-CD8α转化至大肠杆菌 Rostta，经 IPTG 的诱导， SDS凝胶电泳表明,克隆的基因片段在大肠杆菌 Rostta 中得到表达，表达 出融合蛋白 His-CD8α，且表达产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋 白分子量约 39 KD，与预期结果相符。 最后，通过优化表达条件，确定了原核表达重组质粒 pET-32a-CD8α的最佳 诱导时间和诱导剂浓度，用优化的原核表达条件对含有 pET-32a-CD8α质粒的 Rostta 菌进行了大量诱导表达，获得了较高浓度的 His-CD8α包涵体蛋白。用纯 化后的融合蛋白 His-CD8α免疫 Balb/c 小鼠。利用细胞融合技术，制备针对鸡 CD8α的单抗。最后经间接 ELISA、Western-blot 鉴定表明，本实验成功制备了一 II II 株能够稳定分泌抗鸡 CD8α的特异性单抗α-1 细胞株。单抗亚类鉴定结果显示， 单抗属于 IgG2b 亚类。 综上所述，本实验成功克隆了鸡 CD8α的膜外区基因，构建了重组表达载体 pET-32a-CD8α，并对其进行了原核表达，获得了大量融合蛋白 His-CD8α，并制 备了针对该融合蛋白的单克隆抗体α-1，为进一步研究鸡 CD8α分子免疫学功能及 其应用奠定了基础。 关键词：鸡，CD8α，原核表达，单克隆抗体 PAGE PAGE III Abstract CD8 is type ? integral membrane proteins at the surface of T lymphocytes, it’s also one of the remarkable molecules on T lymphocytes cell. CD4 is a monomer, but CD8 is expressed either as an αα-homodimer or an αβ-heterodimer that differ in their biochemical structure.Chicken CD8 is mainly expressed at the surface of cytotoxic T lymphocytes, inhibitory T cells and dendritic cells. In addition, αα-homodimer is mainly expressed on Peripheral