分子克隆常用的DNA聚合酶课件.pptVIP

Ⅱ.几种常见的质粒载体： ① pBR322 pBR322是研究得最清楚应用也最广泛的质粒，全长4363bp，由3种野生质粒成分构建而成，含有Ampr和Tetr两个抗药基因标记，一个复制起始点(ori)，复制子为Col EI。其中ori来自pM9，Ampr来自pRSF2124，Tetr来自pSCl01。在Ampr和Tetr基因中共含有8个限制性酶切位点，以供外源DNA片段的插入。其中在Ampr 基因中的单一酶切位点有PstI、PvuⅡ等；在Tetr基因中的位点有BamHI、HindⅢ、SalI等。 Ⅱ.几种常见的质粒载体： ② pUC18/pUC19 pUC系列质粒是由大肠杆菌pBR质粒和M13噬菌体改建而成的质粒载体。全长2674bp，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点，复制子为Col EI。pUC系列质粒带有一段大肠杆菌Lac操纵子DNA片段，能编码β-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的gal-基因互补。 当pUC质粒转化到gal-的宿主菌后，在含有诱导物IPTG和生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因区域时，造成Lac基因失活，在含有IPTG、X-gal的培养基上将生成白色菌落。  Ⅲ其他载体： M13噬菌株载体： M13噬菌体是一种丝状噬菌体，全长为6407bp，呈闭合环状并以正链单链DNA(single—stranded DNA，ssDNA)形式存在于噬菌体颗粒内。M13只感染具有F因子的雄性大肠杆菌。 限制性内切酶(Restriction Endonuclease) ?? Ⅵ.限制性内切酶使用时的注意事项 ①.?? 要求较纯的底物DNA。 ②.?? Mg2+和Tris-HCl缓冲体系，并且大多数内切酶活性pH范围在7．2—7．6之间； ③.??同时反应体系中不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS以及大于10mmol／L的EDTA； ④.?? 对离子强度的要求分为3个级别， 高盐 (100mmol／L NaCl)， 中盐(50mmol／L NaCl)， 低盐(0～10mmol／L NaCl)。 ⑤.在酶反应缓冲体系中均添加有二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，以稳定酶活性防止氧化。 ⑥.在具体试验操作时应在低温或冰浴条件下完成。 2.分子克隆中常用工具酶 （2）.催化核酸合成的酶类： 分子克隆常用的DNA聚合酶： 依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I。 Klenow片段。 T4噬菌体DNA聚合酶。 T7噬菌体DNA聚合酶。 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。（测序酶） 耐热DNA聚合酶。 依赖RNA 的DNA聚合酶。（逆转录酶） Ⅰ．DNA聚合酶I： DNA聚合酶I是Kornberg从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，商品名称为kornberg酶，分子量109KD。此酶是一个多功能酶，包括3种酶活性： ① 5’-3’聚合酶活性：催化单核苷酸聚合到DNA的3’-OH末端，使DNA链从5’-3’延伸； ② 5’-3’外切酶活性：即从游离的5’末端降解双链DNA或单链DNA成为单核苷酸 ③ 3’-5’外切酶活性。 另外该酶还具有RNA酶H活性。 DNA聚合酶I作用条件： ①4种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+ ② DNA作为模板，单链DNA或有缺口的双链DNA均可； ③ 需要具有游离3’-OH的引物或缺口的3’末端 Ⅱ.TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶，分子量约为94KD。该酶最初由极端嗜热水生菌Thermus aquaticus中提取并纯化，目前已能通过基因工程方式大量生产。 TaqDNA聚合酶的应用 TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中，能以DNA为模板，从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无校正功能。 Ⅲ.DNA连接酶： 催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为DNA连接酶(DNA ligase)。DNA连接酶主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 大肠杆菌的DNA连接酶 ①．T4噬菌体DNA连接酶 T4DNA连接酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现并分离的，分子量68kDa。 特点： A. 催化双链DNA平头末端或黏性末端相邻核酸的5′-P和3′-OH连接反应。 B. 催化双链RNA和杂交双链RNA/DNA连接，但不能催化单链核酸的连接。 C. 可修补在双链DNA