鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达及其部分免疫功能研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

致 谢 此论文完稿之际 首先向我的导师-中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 刘胜旺研究员致以崇高的敬意和由衷的感谢感谢导师对我的辛勤培养和 殷切教诲 感谢导师在我完成课题的两年中在各个方面给予我的支持 理 解和鼓励 导师渊博的学识 实事求是的工作作风和一丝不苟的敬业精神 给我留下深刻印象 这将使我终生受益 感谢我的导师-中国农科院哈尔滨兽医研究所的孔宪刚研究员和新疆 农业大学冉多良副教授在我的学习和生活上给予我的关心和帮助 向中国农科院哈尔滨兽医研究所的童光志研究员在试验中给予我的 支持和帮助表示感谢 向兽医生物技术国家重点实验室第三研究室的刘玉芬博士 独军政硕 士 李桂霞硕士等表示感谢 感谢他们的合作和提出的有益建议 向新疆农业大学动物医学院的简子健院长 岳城教授 单文鲁教授等 老师给予我莫大的鞭策和支持表示感谢 同样感谢我的同学刘建华硕士 杨新艳硕士 刘光亮硕士 李娜硕士 陈艳硕士 海岗硕士 王远志硕士等在诸多方面给予我的帮助和支持 最后 谨以此文献给我的父母和亲人 向他们表示最深情的谢意 韩宗玺 2004 年 6 月于乌鲁木齐 鸡白细胞介素 鸡白细胞介素 18 成熟蛋白的表达及其部分免疫功能研究 新疆农业大学硕士学位论文 新疆农业大学硕士学位论文 PAGE PAGE 11 PAGE PAGE 10 摘 要 白细胞介素 18Interleukine-18 IL-18是 1995 年由 Okmura 等发现的一种细胞 因子 具有强烈的 IFN- 诱生能力 在机体免疫调控中具有重要作用 鸡 IL-18(Chicken IL-18, ChIL-18)则是 Schneider 等 2000 年发现的 医学生物学研究证明 IL-18 在抗微生 物感染 抗肿瘤免疫中具有应用潜力 对于 ChIL-18 的研究尚处于起步阶段 本实验 室在前期的研究中克隆到了 chIL-18 成熟蛋白基因 本研究中 将此基因亚克隆至原核 表达载体 pPROEXTMHT 中 构建重组质粒并进行确证性序列测定 然后将重组质粒转 化大肠杆菌 DH5 并用 IPTG 于 37 诱导培养获得表达 表达形式为包涵体 凝胶薄 层灰度扫描显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的 30% SDS和 Western blot 分 析显示 表达的鸡 IL-18 融合蛋白分子量约为 23 kDa 包涵体通过 6M 盐酸胍裂解后 利用镍离子亲和树脂进行纯化 用所获得的重组 ChIL-18 融合蛋白及其纯化产物经三 次肌肉注射豚鼠 制备豚鼠抗 ChIL-18 多克隆抗体 琼脂扩散实验表明制备的多克隆 抗血清与 ChIL-18 具有良好的反应性 由于原核表达系统存在蛋白修饰不完全的缺点 本研究中还用昆虫细胞/杆状病毒真核表达系统以期表达在结构和活性上更接近天然 chIL-18 的重组蛋白 本实验将编码鸡白细胞介素 18 成熟蛋白的基因亚克隆到杆状病 毒转移载体 pMelBac B 上 构建真核转移载体 pMelBacBChIL-18 经限制性内切酶消 化 ChIL-18 特异引物 PCR 鉴定和确证性序列测定 证明目的基因正确克隆到载体的 预期位点 将纯化的 pMelBacBChIL-18 质粒与杆状病毒 DNA Bac-N-BlueTM DNA 共转染 sf9 昆虫细胞 经四轮 蓝斑筛选纯化 获得了重组杆状病毒 命名为 rBaculovirusChIL-18 提取病毒染色体 DNA 经 ChIL-18 特异引物和重组杆状病毒特 异引物 PCR 鉴定 证明获得了纯化的重组杆状病毒 用该重组病毒接种 sf9 昆虫细胞 收获接种后不同时间的细胞进行 SDS 结果表明 ChIL-18 基因在昆虫细胞中获 得了表达 表达的重组蛋白分子量约为 23KD 应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的 重组蛋白制备的豚鼠抗 ChIL-18 多克隆抗体进行 Western blot 分析 表明本研究真核系 统表达的 ChIL-18 成熟蛋白和前期原核系统表达的 ChIL-18 成熟蛋白均具有生物学活 性 由于昆虫细胞/杆状病毒真核表达系统表达的蛋白量比较低 成本高且不易纯化 因此 本研究在证明了前期原核表达 ChIL-18 具有生物学活性的基础上 应用原核表 达的重组 ChIL-18 蛋白作为广谱的免疫制剂研究了其对肉仔鸡增重作用和对 IBV 的抗 病毒作用 本研究将实验动物分为称重组和 IBV 接种组 每组又设 PBS 对照 细菌蛋 白对照和 ChIL-18 亚组 分别定期口服相应的溶液 称重以及观察 IBV 的感染情况 结果 称重组 PBS 对照和细菌蛋白对照在肉鸡生长期内总增重分别为 1.9314kg 和 1.9180kg,而 ChIL-18 亚组则增重 2.0583kg