环磷酸腺苷在大鼠胰岛素分泌中的作用及其机制-药理学专业论文.docxVIP

2.4 cAMP 影响胰岛素分泌机制的研究 17 2.5 检测溶剂 DMSO 对胰岛β细胞上 KV 通道电流的影响 23 3 讨 论25 4 结 论27 参考文献 28 综 述31 致 谢42 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果43 个人简历 44 山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 I I 换磷酸腺苷在大鼠胰岛素分泌中的作用及其机制 摘 要 目的： 探讨腺苷酸环化酶(AC)/环磷酸腺苷(cAMP)信号转导通路在大鼠胰岛素分泌中的 作用，通过使用 AC 激动剂 Forskolin 和抑制剂 SQ22536 研究 cAMP 影响胰岛素分泌 的机制。 方法： (1)处死大鼠，打开大鼠腹腔，将胶原酶 P(Collagenase P)液从胰总管打入胰腺， 可看到附着在胃和小肠的胰腺，迅速剪下胰腺，将其放到 38℃水浴震荡消化 11 min， 采用 Histopaque-1077，离心分离出大鼠胰岛。用 DispaseⅡ消化胰岛，可得到大鼠原 代胰岛β细胞，为了使研究结果最为接近大鼠生理状态，以上方法分得的胰岛和细胞 最多使用 7 天。(2)DTZ 染液可将胰岛染成猩红色，对其进行染色鉴定，室温下染色 胰岛 10 分钟，在光学显微镜下观察胰岛形态。对胰岛进行活性检测可用 AO/PI 染液 孵育胰岛，用 490 nm 激发光，510 nm 发射光观察。(3)得到的胰岛在 37℃细胞培养 箱培养，用放射性免疫分析法检测 AC 激动剂 Forskolin 和抑制剂 SQ22536 对大鼠胰 岛素分泌及环磷酸腺苷(cAMP)含量的影响。(4)采用膜片钳技术检测药物对胰岛β细胞 电压依赖性钾通道(KV)、动作电位(AP)的影响。(5)采用离子成像技术检测 Forskolin 和 SQ22536 对胰岛β细胞内钙离子浓度的影响。 结果： (1)用胶原酶 P，Histopaque-1077 梯度离心法分得的胰岛，大小不一，折光性好， 直径在 100-300 μm。胰岛β细胞细胞呈球形，质地光滑，表面圆润。(2)胰岛经 DTZ 染色成猩红色，显示在以上实验中分离为胰岛，且纯度较高。95%以上的胰岛经 AO/PI 染色后发绿色荧光，胰岛活性好。(3)在胰岛素分泌实验中，胰岛有明显的葡萄糖依 II II 赖性的促胰岛素分泌作用；在不同葡萄糖浓度下胰岛素分泌的标化值分别是： ±0.38)用特异的 AC 激动剂 Forskolin 和广泛应用的 AC 抑制剂 SQ22536，在 8.3mM 葡萄糖的基础上，Forskolin 增加了胰岛素分泌（8.3 G,n=6vs8.3G+Forskolin， 10μM，n=6，P 0.05）；(4)在有 SQ2253610μ的作用下，可以阻断 Forskolin 增加胰岛 素分泌的作用(8.3G +Forskolinvs8.3G+ SQ22536+Forskolin，10μM ，n=6，P0.05)。 (5) 在 cAMP 量 检 测 试 验 中 ， 所 测 cAMP 值 分 别 为 2.8G 组 999.68±95.82fmol /10islets/hr ， 8.3G 组 1021.77±73.73fmol/10islets/hr,8.3G+SQ22536 组 1187.23± 133.13fmol 10islets/hr， 8.3G+Forskolin 组 3682.14±395.38fmol/10islets/hr ， 8.3G+ SQ22536+Forskolin 组 2947.21±157.63 fmol/10islets/hr。 Forskolin 增加了胰岛β细胞 内生物合成的 cAMP(8.3G n=6 vs 8.3G +Forskolin，10μM，n=6，P0.01)；同时 cAMP 的量没有影响(8.3Gvs8.3G+ SQ22536, 10μM, n=6, P＞0.05)；但是 SQ22536 可以部分 阻断 Forskolin 增加了胰岛β细胞内生物合成的 cAMP 的量(8.3G+Forskolin, 10μM, n=6vs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM, n=6, P0.05)。 (6)通过膜片钳实验看出，KV 通道的开放可被 Forskolin 极大地抑制，减小 KV 电流，同样的情况下 SQ22536 对 KV 电流没有影响，而给予 Forskolin+SQ22536 加药刺激，则可以发现 SQ22536 部分阻断 Forskolin 抑 制 KV 通 道 开 放 的 作 用 。 在 80mV 的 刺 激 时 ， 记 录 电 流 密 度 为 Forskolin(n=6,76.67±2.78pA/pF)