狂犬病毒基础知识及生产工艺分析课件.pptVIP

狂犬病毒基础知识及疫苗生产工艺;目录;　狂犬病病毒归属于弹状病毒科(Rhabdoviridae），病毒形态是一端平坦或略凹状，另 一端为半原形，酷似子弹，故得名弹状病毒，病毒大小75*175nm经组织培养后，病毒的形态多呈两端平坦状的颗粒。单链RNA病毒.?;;狂犬病病毒电镜照片; 狂犬病毒对外界的抵抗力很弱，对温度敏感，60 ℃30~60min，100℃ 2min即可灭活。病毒对阳光、紫外线敏感，各 种常见的消毒剂如肥皂水、碘酒、3%来苏尔、75%酒精等均可使其灭活。 抗生素对其却无灭活作用。? ; 狂犬病病毒最大的特点是对神经组织的嗜性远远大于其他组织。在神经组织内病毒复制的比率远比在其他组织内高。;1、狂犬病毒形状为子弹形，一端为椭圆形，另一端平整。 2、狂犬病毒具有嗜神经性，主要在中枢神经内繁殖。 3、狂犬病毒最初进入伤口时，不进入血液循环，而是在被咬伤的肌肉组织??复制，然后侵入神经系统。 4、狂犬病毒在神经轴中的移动速度约5~100mm/天，如一定范围内（10um-2cm）的轴突同时受感染，病毒移行速度甚至会更快。 ;??　　? 野生动物与家畜是狂犬病的传染源。人类狂犬病由狗、猫直接传染者占90%以上，其次为牛（主要是水牛）、猪、兔、马、驴骡以及野生动物。??;;一般 20 – 60 天 从暴露后数天到数年，差别非常大 主要的影响因素 ;人用狂犬病疫苗发展史;1882年，巴斯德成功在牛脑中分离到狂犬病毒株，并在兔脑内连续传90代，成为固定毒。 1885年，巴斯德尝试研制减毒活疫苗 1911年，Semple在巴斯德的研究基础上，研制出脑组织灭活疫苗； 1956年，Peck研究制备鸭胚疫苗（DEV）。该疫苗在美国和其他国家用作狂犬病暴露后处理并广泛使用了27年，很少观察到严重的副作用，但中和性抗体水平不如脑组织疫苗。 1964年，美国研制出人二倍体细胞疫苗，并于1978年开始商品化，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用。 1984年由法国Merieun研究所研制成功Vero细胞疫苗;国内疫苗发展史;人用狂犬疫苗生产工艺;;原始种子（3aG4）→豚鼠脑内传代（3aG 5）→地鼠肾细胞传代（4aG ）→豚鼠脑内传2代（ 4aG2）→建立主代毒种库 主代毒种库（ 4aG2）→豚鼠脑内传1代（ 4aG3） →建立主工作毒种库 ;毒种制备工艺：;地鼠的挑拣 清洗：纯化水4~6遍，注射用水3遍 消毒：2%甲醛溶液2遍，0.1%新洁尔灭2遍 解剖：扒皮、剪肌、取肾 洗肾： 消化：0.1%胰蛋白酶每对肾加入3~4ml，置2~8℃消化15~18小时。 ;地鼠消毒;解剖地鼠;培养液配制：Hanks’ 液＋营养液＋小牛血清＋硫酸庆大霉素 细胞制备：弃去消化液，洗涤肾块，摇振分散细胞，反复收集数次。 细胞培养：37±1℃培养90-100小时 ;细胞培养;地鼠肾细胞;细胞观察 毒种配制 接种 培养吸附： 34±1℃ 培养吸附18-24小时;维持液配制：199＋0.2~0.4%人血白蛋白＋碳酸氢钠 洗涤细胞 换维持液 病毒培养： 34±1℃ 培养96～120小时 ;细胞观察 收获病毒液：收获标准 加液：加维持液 取样检定 保存：收获液置2~8℃保存、待检；细胞瓶置34±1℃ 继续培养96～120小时 ;收获液检查 无菌转入 加灭活剂：终浓度甲醛溶液250μg/ml 灭活过程：灭活罐内混匀，于34℃±1℃恒温灭活18～20小时 取样检定 ;采用截留分子量为300KD的滤膜超滤浓缩至蛋白质含量在2000～3000μg/ml范围内（浓缩倍数为50±10倍） 按照病毒收获液体积的0.3～0.6倍的灭菌PBS对浓缩液进行分段洗滤 ;浓缩液离心 层析介质为琼脂糖凝胶Sepharose 4FF 纯化：以pH 7.5的PBS洗脱，洗脱液流速240～280ml/分钟，280nm紫外检测,收集第一峰。 取样检定 ;配方计算：抗原含量≥4.5IU/ml，蛋白质含量应不高于80μg/ml 配制：将纯化后原液及终浓度为1%的人血白蛋白、40μg /ml的硫柳汞 转入合并罐内混匀。 取样 ;西林瓶清洗、灭菌：经超声波清洗后350℃ 5分钟干热灭菌 分装：疫苗每支装量不少于标示量 轧盖：通过传输带传至轧盖间，自动上机进行加盖封口 。;外观检查：双眼平视西林瓶，首先检查装量是否准确；再移至目检台黑、白色底板处检查是否有异物。 ;包装规格: 小盒：5瓶/人份 中盒：10人份/盒 大箱：120人份/箱 ;包材喷印 按包装指令上内容对小盒、中盒、大箱、合格证进行调试印制，“产品批号”、“生产日期”及“有效期至”印制位置适中，字体应清晰。 包装前核对 对所有包材印制“产品批号”、“生产日期”及“有效期至”内容的核