美国红鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及其在农药环境雌激素活性筛选中的应用-生态学专业毕业论文.docxVIP

美国红鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及其在农药 美国红鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及其在农药 环境雌激素活性筛选中的应用 学位论文完成日期：羽Z．篷∑≥刍指导教师签字：二谨匝 答辩委员会成员签字：橼 ‘. 独创 独创 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 (洼!翅遣直墓丝益要挂剔直明的!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瘩杀绦 签字日期2吼呔月2阳 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公 众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：≠獭 导师签字： 签字日期切∥年上月2妇 签字日期习研f年岁月2舶 美国红鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及其在农药环境 美国红鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及其在农药环境 雌激素活性筛选中的应用 摘要 有机磷农药和拟除虫菊酯类农药的使用日益广泛，大量使用和残留造成了环 境中含量超标，其中敌敌畏、氧乐果、高效氯氰菊酯、溴甲维磷在体外试验或理 论推测中被认为可能具有环境雌激素活性，但其在动物体内的环境雌激素活性尚 需进一步证实。目前应用最为广泛的环境雌激素活体筛选指标是鱼类卵黄原蛋白 (Vitellogenin,Vtg)，其检测原理是基于Vtg作为抗原能与其抗体发生免疫反应。 由于鱼种间Vtg具有较高的种属异质性，有必要根据不同鱼种确定合适的分离纯 化方法，将纯化的Vtg作为免疫原用于制备特异性的抗体或抗血清，从而将其应 用于环境雌激素的筛选。美国红鱼是沿海重要的增养殖鱼种，可通过水体环境直 接暴露于农药等环境污染物。本研究选用美国红鱼为实验动物，确定了美国红鱼 Vtg分离纯化方法，研究了其基本性质，制备了美国红鱼Vtg多克隆抗血清，并 通过蛋白质免疫印迹评价了敌敌畏、氧乐果、高效氯氰菊酯、溴甲维磷四种常用 农药的环境雌激素活性。研究结果表明： 采用肌肉注射2∥g儋(Bw)1修雌二醇(E2)诱导美国红鱼两周，取血浆进行 Native．PAGE，通过磷、脂、糖特征基团染色，表明E2诱导美国红鱼合成Vtg。 Vtg的分离纯化采用两种方案进行，Native．PAGE与SDS—PAGE结果表明选择性 沉淀结合离子交换层析与凝胶过滤结合离子交换层析相比，获得的V馏纯度与得 率均高，并且极少发生降解。美国红鱼Vtg天然分子量为560 kDa，进行SDS—PAGE 得到176 kDa单体。 利用纯化的美国红鱼V蟾免疫昆明小鼠与新西兰兔，采用双向免疫扩散测定 多克隆抗血清效价均可达到1：32，Western blot显示多克隆抗血清对Vtg纯品和 E2诱导血浆均发生阳性反应，并且阳性条带的位置相同，表明抗血清特异性较高。 采用Western blot测定多抗血清(1：600)对美国红鱼Vtg的最低检出限，鼠抗血清 为0．90．ug／ml、兔抗血清为0．45∥eCml。 利用美国红鱼Vtg多克隆抗血清作为第一抗体，辣根酶标记羊抗鼠／兔IgG 作为第二抗体，采用Western blot技术定性检测高效氯氰菊酯、溴甲维磷、敌敌 和 和 克 红 敌 测 与 隆 疫 评 Preparation Preparation of polyclonal antisera against vitellogenin from Sciaenops ocellatus and its application to screening pesticides WIth estrogenic activities Abstract In China,organophosphate and pyrethroid pesticides has been extensively used in agriculture，ever since organochlorine pesticides Was forbidden．According to the yearbook of agricultural statistics，annual production and consumption of ag