氯离子转运体kcc2和脑缺血的研究-神经生物学专业毕业论文.docxVIP

中国科学技术大学博士学位论文这些脑区包括嗅球、视交叉上核、脊髓的背根神经元以及缰内侧核(medial 中国科学技术大学博士学位论文 这些脑区包括嗅球、视交叉上核、脊髓的背根神经元以及缰内侧核(medial habenula，MHb)。嗅球、视交叉上核和脊髓背根神经元因缺少KCC2的氯离 子外排作用而表现出对GABA呈现兴奋性作用。但MHb不表达KCC2的 mRNA，人们至今尚不清楚GABA在MHb起兴奋性作用还是抑制性作用。 在本研究中，为探讨脑缺血对KCC2表达的影响，使用全脑缺血模型研 究缺血后海马KCC2表达的改变，在此基础上进一步探讨缺血性KCC2表达改 变的机制；为探讨GABAA信号通路在MHb的作用，使用免疫荧光染色和激 光共聚焦成像技术检测GABAA信号通路相关蛋白在此核内的表达和亚细胞分 布，j并用电生理记录手段进一步研究GABAA信号通路相关的电生理活动。 主要的实验结果如下： 1．全脑缺血导致海马CAl区神经元KCC2选择性表达下调，其下调是由 NMDA受体激活导致的，不是由BDNF--TrkB信号通路介导 (1)．全脑缺血导致海马KCC2下调 全脑缺血15min，复灌12hr后海马CAl区的KCC2表达明显下调。并被 培养海马神经元的氧气．葡萄糖剥夺实验证实。 (2)．BDNF．TrkB信号通路不参与缺血性KCC2下调 采用免疫印迹和免疫荧光法检测全脑缺血复灌后不同时间的BDNF和 TrkB受体表达，结果显示缺血复灌12hr后BDNF和TrkB表达均无明显改 变，缺血前侧脑室注射BDNF并不能增加KCC2下调，而注射BDNF的抑制 剂YrkB--Fc也不能抑制KCC2下调。 (3)．NMDA受体激活导致缺血性KCC2下调 II 中国科学技术大学博士学位论文缺血前侧脑室注射NMDA受体拮抗剂可有效阻止缺血性的KCC2下调， 中国科学技术大学博士学位论文 缺血前侧脑室注射NMDA受体拮抗剂可有效阻止缺血性的KCC2下调， 而AMPA受体拮抗剂CNQX则无此作用。进一步的研究表明脑内注射calpain 的拮抗剂也能够有效抑制缺血导致的KCC2表达下调。 2．成年大鼠的缰内侧核缺少KCC2一GABAA信号系统 (1)．MHb缺少GABAA信号系统相关蛋白的表达。 使用免疫荧光染色，在MHb检测不到KCC2、GABAAR[32／3亚基和 GAD65阳性信号，但在海马和LHb可以观察到有明,_显KCC2、GABAAR[32／3 亚基和GAD65阳性染色，这表明，在免疫荧光的检测水平，MHb缺少 GABAA信号系统相关蛋白的表达。 (2)．MHb没有GABA介导的电流 全细胞记录，GAGA在MHb不能激活明显的GABAA电流，但在LHb和 海马，却可以诱导明显的外向电流，该电流可以被GABAA受体特异性的拮 抗剂bicuculline完全抑制；在MHb不能记录到微小抑制性突触后电流 (miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs)，而在LHb禾[1海马可 以记录到对bicuculline敏感的mIPSCs。 (3)．GABABR信号系统缰内侧核存在 免疫荧光染色表明，MHb有GABA，GAD67和GABABR 2亚单位的阳性 表达。外源性的balcofen(GABAB激动剂)可以在MHb以及LHb诱导出 明显的外向电流，该电流可以被GABAB受体的特异性拮抗剂phaclcofen所 抑制。 结论：全脑缺血可以选择性降{氐KCC2在海马CAl区神经元的表达，这 一机制不是由BDNF介导而是通过NMDA受体激活蛋白水解酶calpain来实现 III 中国科学技术大学博士学位论文的。MHb缺少KCC2．GABAA信号通路，其它的抑制性信号系统如GABAB或 中国科学技术大学博士学位论文 的。MHb缺少KCC2．GABAA信号通路，其它的抑制性信号系统如GABAB或 其它的抑制性信号系统在此发挥抑制性作用； 关键词：钾离子．氯离子共转运体2；^r一氨基丁酸；Y一氨基丁酸A受体；氯 离子；Y一氨基丁酸B受体；缰内侧核；微抑制性突触后电流；缺血；海马； NMDA受体。 中国科学技术大学博士学位论文Abstract 中国科学技术大学博士学位论文 Abstract Stroke is one of the most important diseases．It also is primary reason of paralysis．Transient cerebral ischemia induces a cascade of cellular events that eventually produces neuronal death．Among events，NMDA(N—met