螺原体细胞骨架蛋白与其细胞形态关系的研究-水产学;水产养殖专业毕业论文.docxVIP

目录目录 目录 目录 摘要 ．．I Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．IV 第一章文献综述 ．．1 l螺原体的研究概况 ．．1 1．1螺原体的分类地位 l 1．2螺原体的发现与报道 1 1．3螺原体的基本生物学特性 4 2中华绒螯蟹螺原体的研究进展 6 2．1中华绒螫蟹颤抖病的流行病学调查 6 2．2中华绒螯蟹螺原体的研究进展 7 3柔膜体纲螺原体细胞骨架蛋白的研究进展 一9 4本论文的研究目的、内容、意义和技术路线 13 4．1本论文的研究内容如下： ．13 4．2本论文的实验技术路线如下： ．14 第二章螺原体细胞骨架蛋白的生物信息学分析 ．．15 l研究方法 l 5 2结果与分析 l 5 2．1碱基和氨基酸序列相似性 ．15 2．2三级结构 ．．1 6 ：}讨论 l 7 第三章螺原体细胞骨架蛋白的荧光定量PCR检测 19 1实验材料 l 9 1．1实验仪器 ．．19 1．2实验试剂 ．1 9 1．3引物设计与合成 ．．20 2实验方法 ．2 l 2．1螺原体培养 ．21 2．2 RNA提取 。21 2．3去I涂DNA ．22 2．4测量RNA浓度 ．23 2．5反转录 ．23 2．6 Real Time PCR反应 23 3实验结果 24 3．1中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)实验结果 24 3．2非凡螺原体(Spiroplasma mirum)实验结果 一28 4讨论 3：! 第四章中华绒螯蟹螺原体细胞骨架蛋白EF-Tu(延伸因子)的序列分析、克隆、表达及与 寄主相互作用关系 36 、实验枕聃 ．36 1．1实验仪器 ．36 1．2实验试剂 1．2实验试剂 ．37 1．3引物漫计与合成 ．40 2实验方法 40 2．1提取中华绒螯蟹螺原体基因组DNA 40 2．2 EF-Tu基冈PCR扩增 ．．4l 2．3 EF-Tu基冈PCR产物沉淀回收 一42 2．4构建表达载体pET-28a 42 2．5连接EF-Tu基冈与表达载体pET-28a 43 2．6 pET-EF-Tu连接产物的转化 44 2．7重组蛋白的表达与鉴定 ．44 2．8重组蛋白的纯化 。45 2．9重组蛋白的质谱分析 。46 2．10多克隆抗体的制备与效价检测 48 2．1 l Western Blotting j子析 ．．49 3实验结果 ．50 3．1中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取、EF-Tu基因PCR扩增及序列分析。50 3．2构建重组质粒pET-EF-Tu 52 3．3重组蛋白的表达、纯化与鉴定 ．53 3．4重组蛋白的质谱分析 ．54 3．5 EF．Tu重组蛋白多克隆抗体的制备与效价检测 54 3．6螺原体蛋白Western Blotting分析 55 4讨论 5(； 全文小结 ．．59 展望 ．60 参考文献 ．．61 附录：读研期间科研成果 71 致谢 ．72 摘要摘要 摘要 摘要 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国沿江地区重点开发的特种水产养殖 动物。近年来，随着养殖规模的不断扩大和集约化养殖程度的不断提高，各种病 害问题日趋严重，给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的经济损失。在中华绒螯蟹的 众多病害中，颤抖病是最常见、危害最为严重的一种。本课题组前期研究证明该 病病原体为螺原体，并将其命名为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris sp． nov)。虽然前期工作已经完成了该病原体的生物学特性与分类地位的研究，以及 病原检测和治疗药物的毒理实验，但有关其细胞骨架蛋白功能方面的研究还没有 涉及，而螺原体的细胞骨架因为其独特性近年来成为国际研究的热点。因此，本 论文在中华绒螯蟹螺原体和非凡螺原体(Spiroplasma mirum)基因组测序和注释 工作的基础上，运用多种生物信息学软件，对不同螺原体的细胞骨架蛋白(fib， EF．Tu和MreB l～5)进行了一系列分析和比较，并开展了三种细胞骨架基因 (只6、EF-Tu和MreB)的实时定量PCR检测以及EF．Tu蛋白的原核表达和多 抗制备。 1．螺原体细胞骨架蛋白的生物信息学分析 中华绒螯蟹螺原体(eriocheiris)是第一种发现于淡水甲壳动物中的螺原 体，它在各生长时期的形态差异很大，而螺原体是无细胞壁的微生物，所以这种 形态学上的变化很可能与细胞骨架有关。因此为了进一步研究其与植物螺原体 (柑橘螺原体，Spiroplasma cirri)和昆虫螺原体(非凡螺原体，Spiroplasma mirum； 蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum)以及其他细菌细胞骨架的关系，本实验