猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建-外科学(骨外科学)专业毕业论文.docxVIP

猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建 猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建 杨光诗 中文摘要 经移植体。由于化学萃取的猕猴同种异体神经可去掉其免疫原性，同时还具备适 宜神经再生的微结构。因此我们从人工神经的以上两个主要因素即种予细胞和 人工支架来优化人工神经，利用猕猴前臂的尺神经来进行体内外的科学研究。 【方法】 (一)、细胞培养：采用剃度离一tl,的方法培养猕猴骨髓间充质干细胞。1 ，由于 其具有较强的自我增殖能力，从而可以在较短的时间内培养出大量的骨髓间充质 干细胞，能够为人工神经的构建提供必需的种子细胞， (二)、去细胞猕猴同种异体神经：利用Triton．X-100和脱氧胆酸钠液采用 化学萃取的方法去除掉异体神经的主要免疫成分一雪旺细胞及髓鞘结构等：萃取 好的异体神经放入PBS液4 4C保存备用对上述萃取一次和两次的神经行HE染 色、S-100免疫组化、纤维素染色及砂罗铬花青染色及透射电镜和扫描电镜检测， 了解萃取结果： (三)、猕猴骨髓闻充质干细胞种植于去细胞同种异体神经构建人工神经的 体外研究：在10倍显微镜下用10微升微量加样器把一定数量的第三代猕猴骨髓 间充质干细胞按106／ml的浓度种植到化学萃取同种异体神经，注射时用微量加样 器的针头纵行穿刺入化学萃取同种异体神经，边注射边退出针头，会发现白色的化 学萃取同种异体神经逐渐膨胀并变为粉红色(因为细胞培养基的颜色为粉红色)， 把注入细胞的化学萃取同种异体神放入含有培养基的六孔培养扳中培养，并于立 刻及第3及第5天行HE染色检测了解细胞的分布情况： (四)、猕猴骨髓间充质干细胞种植于去细胞同种异体神经构建人工神经的体 内研究：在2．3岁猕猴肘关节远端ICM处为起点向远端切除4CM神经，造成神经 缺损，并采用以下三种方式进行修复：(J)猕猴骨髓间充质干细胞种植于化学萃取同 种异体神经构建的人工神经：(2)细胞培养基注射入化学萃取同种异体神经构建的 人工神经：(3)自体神经移植三组均于术后6个月行电生理及组织学HE和NF免 疫组化检测 【结果】 (一)．经上述密度剃度离心法培养的骨髓问充质干细胞原代大约需要1l到 12天，行第一次传代，以后的传代细胞大约需4到5天，行第二、第三、第四等 II 猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建 猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建 杨光诗 中文摘要 依次传代随着传代次数的增加，细胞形态均一性提高，在相差显微镜低倍下观察 细胞呈旋涡状生长，细胞呈长梭状，一般有两个突起，部分细胞有三个甚至更多的 突起，有的细胞会看到正处在核分裂状态： (二)化学萃取猕猴同种异体神经的检测显示砂罗铬花青染色及S-100免 疫组化萃取一次的异体神经尚存在一定的髓鞘，没有萃取彻底，而萃取两次的异体 神经则基本彻底，未见到髓鞘，同时行纤维素染色，可见异体神经的纤维支架结构 完整，未被化学萃取剂破坏； (三) 猕猴骨髓间充质干细胞种植于化学萃取同种异体神经立刻及体外培 养3天和5天后行HE染色发现：刚刚注射完时细胞比较集中在萃取的同种异体神 经的中部，体外培养3天后细胞己明显扩散开：培养5天的与培养3天有相似的结 果，因此可选择在体外培养三天的复合物作为进一步的体内实验； (四)术后六个月行电生理及病理学检测神经功能恢复情况：大体和电生理 检测发现尺神经的运动功能得以恢复，取材时可见异体神经与周围组织易于分 离，未发生明显的免疫反应，并且可见再血管化：病理学检测并行统计分析发现， 去细胞桥接物作为神经支架可支持神经纤维的再生，同时猕猴骨髓问充质干细胞 能进一步促进轴突的再生，与自体神经移植无统计学差异。 【结论】 (1)猕猴骨髓间充质干细胞自我增殖能力强，符合组织工程学中种子细胞所 需的要求： (2)用4％triton．X-100液和4％脱氧胆酸钠液所萃取的同种异体周围神经己 清除掉神经中的细胞成分，剩余由纤维成分所构成的神经内膜管， (3)．猕猴骨髓间充质干细胞种植于化学萃取同种异体神经构建的人工神经 能较好的修复4CM的周围神经缺损． 【关键词】周围神经猕猴组织工程细胞培养化学萃取人工神经 自我增殖髓鞘轴突 lII 猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建 猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建 杨光诗 The optimization constructon of artificial nerve by rhesus maceque mesenchymal stem cells and acellular nerves Major Su唱e哆 M．D Candidate： fang