钙拮抗剂通过TNF-α2fNF-κB环路介导的非钙通道阻断作用抗心肌细胞缺氧复氧损伤的研究.doc

万方数据 万方数据 汕头大学硕士学位论文 摘 要 钙拮抗剂（Ca lc ium a nta go nists）是一类选择性阻止电压依赖性钙通道，抑制细胞外 Ca2+内流，降低细胞内 Ca2+浓度的药物。按照化学结构，钙拮抗剂主要分为 3 类：二氢吡 啶类，硫氮杂卓类，苯烷胺类。碘化 N-正丁基氟哌啶醇（N- n- butyl haloperidol iod ide，F2） 是我课题组研究合成的一个新化合物。前期研究表明，F2 有拮抗钙超载保护心肌缺血再 灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤或心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R） 损伤的作用。F2 能够激活非钙依赖型 PKCε 转位，保护心肌细胞 H/R 损伤；此外，在 L- 型钙通道缺失的心脏微血管内皮细胞上，F2 对 H/R 损伤依然有保护作用。文献报道，地 尔硫卓、氨氯地平和维拉帕米可通过不依赖于改变细胞内钙浓度的途径影响转录因子 NF-IL6 和 NF-κB 的活性。上述研究结果提示，钙拮抗剂对心肌细胞 H/R 损伤具有非钙依 赖的保护机制。肿瘤坏死因子（t umor necrosis fac tor alp ha, TNF-α）作为一种多功能的细胞 因子，在炎症反应、免疫应答等多种生理、病理过程中发挥着重要作用 。有文献报道，心 肌 I/R及心肌细胞 H/R刺激下，TNF-α 激活且表达上调是导致心肌功能紊乱的一重要因素。 结合前期的基因芯片数据，在无钙液 H/R 模型中，TNF-α 表达上调，F2 处理后 TNF-α 表 达下调。提示我们，TNF-α 可能参与无钙液 H/R 引起的心肌损伤。因此，本研究首先通 过观察无钙液条件下 H/R 心肌细胞中 TNF-α 的变化，及钙拮抗剂对 TNF-α 表达的影响； 进一步探讨无钙液 H/R 时，H9C2 心肌细胞是否介导 TNF-α/NF-κB 环路以及钙拮抗剂是 否可以通过调节此环路保护心肌细胞 H/R 损伤。 方法： 第一部分 钙拮抗剂对无钙液 H/R 心肌细胞中 TNF-α 表达的影响 将培养的 H9C2 心肌细胞随机分组：①对照(Ca2+1h)组；②无钙液(0 Ca2+)组；③无钙液 缺氧复氧（0 Ca2+H/R）组；④无钙液 + 不同钙拮抗剂组；⑤无钙液 + DMSO 组；⑥无 钙液 H/R + DMSO 组；⑦无钙液 H/R + 不同剂量钙拮抗剂组。 Real- Time PCR 方法检测 H9C2 心肌细胞中 TNF-α mRN A 水平。 ELISA 方法检测 H9C2 心肌细胞培养上清液中的 TNF-α，IL-6，IL-10 浓度。 线粒体膜电位（JC-1）方法检测 H9C2 心肌细胞早期凋亡。 I 万方数据 汕头大学硕士学位论文 比色法检测 H9C2 心肌细胞中乳酸脱氢酶（LDH）含量。 第二部分 钙拮抗剂对无钙液 H/R 心肌细胞中 TNF-α/NF-κB 环路的影响 将培养的 H9C2 心肌细胞随机分组：对照（Ca2+1h）组、无钙液 1h(0 Ca2+1h)组、无钙液 H/R 组、无钙液 H/R + DMSO 组、无钙液 H/R + F2 组、无钙液 H/R + Ver 组 、无钙液 H/R+ Dil 组 、无钙液 H/R + Nif 组、无钙液 H/R + F2 + TNF-α 组、无钙液 H/R + Ver + TNF-α 组、 无钙液 H/R + TNF-α 组、无钙液 H/R + anti- TNF-α mab 组、无钙液 1.0h + TNF-α 组、无钙 液 H/R + PDTC 组、无钙液 H/R + LPS 组,、control + P65 组、control + vecter 组。 ELISA 方法检测 H9C2 心肌细胞培养上清液中的 TNF-α，IL-6，IL-10 浓度。 Wester n- b lot 法检测无钙液 H/R H9C2 心肌细胞 p-P65，P65，p-IKB-α，IKB-α，p-IKKα/β， IKKα/β 蛋白表达的变化。 线粒体膜电位（JC-1）方法检测 H9C2 心肌细胞早期凋亡。 比色法检测 H9C2 心肌细胞中 LDH 含量。 双荧光素酶报告基因(Dual-Luciferase)检测 H9C2 心肌细胞 NF-κB Luciferase，TNF-α promoter Luciferase 荧光比值。 免疫荧光检测 H9C2 心肌细胞 NF-κB 的核转位。 结果： 第一部分 钙拮抗剂对无钙液 H/R 心肌细胞中 TNF-α 表达的影响 无钙液培养可刺激 H9C2 心肌细胞生成 TNF-α，无钙液培养 1h 后随着培养时间的延长 释放生成的 TNF-α 含量逐步升高，钙拮抗剂对无钙液培养