塞来昔布联合5-Fu对SGC-7901人胃癌细胞凋亡及COX-2、Bcl-2、Bax的影响.doc

山西医科大学硕士学位论文 材料与方法 材料 细胞 SGC-7901 人胃癌细胞 武汉博士德生物工程有限公司 主要试剂 兔抗人 COX-2 蛋白单克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 兔抗人 Bc l-2 蛋白单克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 兔抗人 Bax 蛋白单克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 免疫组化试剂盒 北京博奥森生物技有限公司 塞来昔布 购自辉瑞公司 5-Fu 购自上海旭东制药厂 胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司 RPMI1640 培养基 为 G ibco BRL 公司产品 胰酶 武汉博士德生物工程有限公司 二甲基亚砜（DMSO） 美国 S igma 四甲基偶氮唑蓝（MTT） 美国 Sigma 碘化丙啶（PI） 北京博奥森生物技有限公司 DAB 北京博奥森生物技有限公司 主要仪器及设备 层流洁净细胞培养室 山西医科大学寄生虫实验室 CO2 培养箱 （1815TC）SHEL-LAB 无菌工作台 北京新技术应用研究所 流式细胞仪 BECTON DICKINSON 公司 低温冰箱 SANYO 公司 倒置显微镜 日本 NIKON 公司 台式离心机 湖南湘仪离心机厂 光学显微镜 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司 主要试剂的配制 （1）MTT 溶液（5mg/ml）：取 MTT50mg，充分溶解于 10mlPBS（0.01M,pH7.2~7.4）中过 滤除菌，分装，-20℃保存。 （2）磷酸盐缓冲液（1×PBS）缓冲液：称取 NaCl 8.5g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 2.85g， KH2PO4 0.27g，溶于 400mL 三蒸水中 ，调 pH 值 ，定容至 1000mL，高温高压除菌 ，4℃保 存。 （3）0.25%胰酶溶液：称 0.25g 胰蛋白酶粉，加 100mL PBS 液，完全溶解后调 PH 为 7.4， 2 山西医科大学硕士学位论文 过滤除菌，密封后 4℃保存。 主要药物的配制 （1）塞来昔布原液的配制：以 DMSO 配成 1mo l/L 的贮存液[13]，放置-20℃冰箱保存，临 用时培养液稀释成所需浓度。 （2）5-Fu 原液的配制:取 5-Fu 注射液(250mg/支，10ml/支)lmL，加入 9mLRPMI-1640 培养 液，混匀，配制成浓度为 2.5mg/mL 的 5-Fu 原液，放置-20℃冰箱保存，临用时培养液稀释 成所需浓度。 方法 细胞培养 将 SGC-7901 细胞癌细胞常规培养于含 10%胎牛血清和双抗(青霉素 100 U/ml 及链霉 素 100μg/ml)的 RPMI1640 培养液中，置于 37℃、5%CO2 培养箱内培养，隔天换液，2～ 3d 以 0.25%的胰酶消化传代。根据相关文献选用药物作用 48 小时进行实验[13]。 MTT 检测塞来昔布和 5-Fu 对 SGC-7901 细胞增殖的影响 单独作用 （1）收集对数生长期的 SGC-7901 细胞，胰酶消化调整细胞密度至 7×104/ ml，以 100μl/孔 接种于 96 孔板，每孔接种 7×103 个/孔，常氧下、37℃、5%CO2 培养 24h 待细胞贴壁。 （2）24h 后换液，分别加入赛来昔布（终浓度为 0、10、20、40、80、100 μ mol/L）及 5-F u(终 浓度为 0、10、20、40、60、80、100μg/mL)，同时设调零组，每组设 6 个复孔。 （3）作用 48h 后，MTT 法检测细胞增殖抑制率。每孔加 MTT 溶液 20μ l（5 mg/ml），37℃ 孵育 4 小时。 （4）弃去培养液，每孔加 DMSO 150μ l，振荡至紫色结晶完全消失，用全自动酶标仪测定 490nm 波长各孔的吸光度 A 值（A490）。 （5）按下式计算细胞增殖抑制率。细胞生长抑制率(R)=(1-A 实验组/A 对照组)×100%。 联合作用 取对数生长期的 SGC-7901 细胞，调整细胞密度至 7×104/ml 接种于 96 孔板，每孔 7×103 个/孔。24h后换液，将细胞分为8组：对照组、C组（ce le co xib 20μ mol/L）、F1组（5-Fu40μg/ml）、 F2 组(5-Fu60μg/ml)、F3 组（5-Fu80μg/ml）、C+F1 组、C+F2 组和 C+F3 组，每组设 6 个复 孔，作用 48h 后按 1.2.2.1 检测细胞增殖抑制率 流式细胞仪检测细胞周期分布 （1）取对数生长期的 SGC-7901 细胞，调整细胞 3×105 个/孔，接种于 6 孔板常氧下、37℃、 5%CO2 培养 24h 待细胞贴壁。 （2）24h 后换液，将细胞分为 4 组：对照组、C 组（ce leco xib 20μ mol/L）、F