泌盐植物中华补血草SOS1基因的克隆及其功能研究-海洋生物学专业毕业论文.docx

万方数据 万方数据 烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在非保密的论文范围内，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘要 盐胁迫是严重影响植物生长发育的非生物因素之一。土壤盐渍化会引起大多数 植物体内 Na+过量积累，进而影响植物的生长。盐生植物能在盐渍环境下正常生长， 因此，克隆盐生植物的耐盐性关键基因并研究其功能，有助于深入理解植物的耐盐 机制，利用相关的基因资源，培育转基因耐盐植物，有效地改善和利用盐渍化土地。 本实验以泌盐盐生植物中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为材料，首先研究 了补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应、SOS1 基因的表达变化及中华补血草叶片 中抗氧化酶的活性变化；其次，克隆了中华补血草 SOS1 基因（LsSOS1），构建了过 量表达载体、融合基因表达载体及沉默干扰表达载体，在拟南芥中将 LsSOS1 基因进 行了过量表达和 LsSOS1-GFP 融合基因的表达并在中华补血草中做了 LsSOS1RNAi 遗传转化。对获得的纯合转基因拟南芥及 LsSOS1 沉默转基因中华补血草进行分子鉴 定、耐盐性分析、LsSOS1 表达产物定位观察及 LsSOS1 基因的表达变化研究。进一 步了解 LsSOS1 基因在盐生植物中华补血草耐盐过程中的重要作用。 实验主要结果如下： (1) 中华补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应及 LsSOS1 基因的表达变化 弯根实验中，低盐浓度下补血草根的生长情况好于对照，随着盐浓度的升高， 根的生长逐渐受到抑制。NaCl 浓度高于 200mmol/L 时，中华补血草受到盐胁迫， LsSOS1 基因的表达量升高，根部高于叶片。 (2) 盐胁迫下中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化 中华补血草在低盐处理下，酶促活性氧自由基清除系统的各种酶活性与对照 相比没有明显变化。但是，随着 NaCl 浓度的增加，中华补血草受到盐胁迫，活性氧 清除酶类（SOD、POD 、APX、CAT）的酶活性上升。说明在一定的浓度范围内， 补血草可以通过调节自身的抗氧化酶系统及其独特的泌盐、耐盐机制来抵御盐胁迫 带来的损伤，维持正常的生长。 (3) 中华补血草 LsSOS1 基因的克隆及序列分析 根据其他物种中保守的 SOS1 基因序列，设计简并引物，利用 RACE 的方法 克隆得到 LsSOS1 基因序列，开放阅读框包含 3456 个核苷酸，推导编码的蛋白质有 I 1152 个氨基酸残基组成，与大叶补血草 SOS1 基因（ Limonium gmelinii SOS1）的同 源性最高，达到了 97%，编码一种 Na+/H+逆向转运蛋白。 (4) LsSOS1 基因异源过量表达研究 筛选得到了 10 个过表达 LsSOS1 的转基因拟南芥株系，选用三个纯合转基因株 系进行分子研究和生理生化分析。通过 Real-time PCR 分析 LsSOS1 基因在拟南芥中 表达量的差异。在不同浓度 NaCl 胁迫下，转基因植株的萌发和生长情况要优于野生 型，转基因植株比野生型植株的耐盐性有所提高，转基因植株的鲜重、干重及 K+/Na+ 比率高于野生型，但是转基因植株间的差异并不明显。 (5) LsSOS1 表达产物亚细胞定位分析 筛选得到过量表达 P35S::LsSOS1-GFP 的转基因拟南芥。在共聚焦显微镜下通过 观察 GFP 的绿色荧光确定 LsSOS1 表达产物的定位。初步确定了 LsSOS1 在细胞膜或 细胞壁上表达，而不是在液泡膜或细胞质中。为了进一步确认是在细胞质膜上，可 以用甘露醇将细胞皱缩质壁分离，再进行观察。 (6) LsSOS1RNAi 沉默转基因中华补血草耐逆性分析 通过优化遗传转化体系，外植体的转化率达到了 20%，筛选获得了 30 株 Ls SOS1RNAi 沉默转基因株系。 对其中的 3 个株系进行 LsSOS1 基因的表达研究