黄葵胶囊对大鼠肾小管间质纤维化及PTEN的影响-免疫学专业毕业论文.docxVIP

泰山医学院硕士学位论文 泰山医学院硕士学位论文 万方数据 万方数据 黄葵胶囊对大鼠肾小管间质纤维化及 PTEN 的影响 研究生：焦 贺 专 业：免疫学 导 师：宋文刚 教授 中文摘要 目的 慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）目前在全球的发病率已达到 10%， 中国大陆的发病率高达 10.8%，这种疾病因其具有“高发病率、低知晓率”的特点而往 往被人忽视，根据病情的不同呈现不同进展速度，很大一部分患者最终进入终末期肾 脏病（End stage renal disease，ESRD）阶段，也就是常说的“尿毒症”。这部分患者往 往生活质量非常差，死亡率高。他们不仅忍受身心的巨大痛楚，同时给家庭及社会均 带来极大负担。阻止 CKD 的发展或者对 CKD 患者进行有效治疗，是目前临床肾脏 病医生工作的重点及难点所在。当前，很多研究都集中于肾小球的相关病变，但针对 肾小管间质病变的相关研究比较少，也许其与 CKD 的预后关系更加密切。肾小管间 质病变发生发展的相关机制是研究慢性肾脏病的另一重点内容。它对延缓慢性肾脏病 患者发展为尿毒症的进程有不可忽视的重要意义。本实验目的是研究黄葵胶囊对大鼠 肾小管-间质纤维化及其肾组织中抗纤维化因子 PTEN（染色体 10 上缺失的磷酸酶与 张力蛋白同源物基因）表达的调节作用。通过实验室指标和病理改变探讨分析 PTEN 与肾小管-间质纤维化的相关性，为黄葵胶囊治疗慢性肾脏病并有效延缓其进展寻找 有力证据。 方法 清洁级雄性 SD 大鼠，行尿常规检测，选取阴性 40 只。随机抽取 10 只为假手术 组（Ⅰ组，n=10），其余 30 只做 5/6 肾切除，从中选取 20 只术后状态较好的分为模 型组（Ⅱ组，n=10）和黄葵治疗组（Ⅲ组，n=10）。大鼠给药剂量按体表面积计算， 相当于成人剂量的 6.3 倍。假手术组和模型组蒸馏水灌胃，黄葵胶囊治疗组用黄葵胶 囊粉末溶剂灌胃，剂量为 262mg/kg/d，持续给药 4 周。留取 24 小时尿液，行 24 小时 尿蛋白定量测定。腹主动脉取血，行血肌酐、尿素氮检验。剥离肾脏，冰上修剪组织 块，按重量分成四等份。 一份 10%甲醛溶液固定，24 小时候内做成蜡块，4℃冰箱内保存，用于 HE 染 1 色、PASM 染色检测。观察光镜下肾组织病理改变情况。 一份锡箔纸包裹置-80℃冰箱保存，制冰冻切片。选择免疫荧光抗体技术检测大 鼠肾组织中 PTEN 蛋白的表达部位及表达强度，并用相关软件分析荧光标记结果，半 定量分析荧光相对强度。 一份置于液氮生物容器中速冻后转移至-80℃冰箱保存，用于 ELISA 蛋白定量检 测分析。采用双抗体夹心法，先制备肾组织匀浆，梯度稀释标准品，在抗体包被的酶 标板上分别设置空白孔、标准品孔及样品孔，依梯度浓度加样，按 ELISA 试剂盒使 用步骤操作，标准品浓度做为横坐标，其对应的 OD 值做为纵坐标，于坐标纸上找出 相对应的点，连接绘出标准曲线（或计算标准曲线直线回归方程式），将样品 OD 值 带入标准曲线，得出样品的浓度；再乘以稀释倍数，算出样品的最终浓度。 一份肾组织在剪碎以后置于样本保存液中，置于-80℃冰箱中冷冻保存，留做 RT-PCR 用于检测大鼠肾组织 PTEN mRNA 表达。实验所用的物品均行去 RNA 酶处 理，严格按说明书操作， 逐步提取 RNA，测定总 RNA 质量，评价 RNA 是否提 取成功。此过程需全程于冰盒中操作，反应体系设定为 20ul。首先查询所需相关引物 的序列（参考 Gene Bank，即 pubmed 的 structure），根据设计软件 primer5.0 及其设计 要求，委托捷瑞生物（上海）工程有限公司合成，选定内参为 β-actin，反应体系设为 25ul，加入 5ul cRNA 为聚合酶链式反应的模板，进行 mRNA 合成。琼脂糖凝胶电泳， 于紫外灯下查看观察电泳结果并拍照，如果待测基因 RT-PCR 产物行凝胶电泳后能在 紫外灯下各自呈现 PTEN：446bp、β-actin：186bp 的荧光条带则为阳性结果。用 CENE GENIUS 凝胶图像分析软件分析 RT-PCR 所得结果，条带的积分光密度（IA）=面积× 平均吸光度，公式：目的片段的相对量（IA 比值）=IA（目的片段）/IA（内对照）。 结果 1、病理诊断：光镜下观察石蜡组织切片，可见Ⅰ组肾小管无萎缩，无间质纤维 化及炎细胞浸润；Ⅱ组肾小管重度萎缩，间质明显纤维化伴炎细胞灶性浸润；Ⅲ组肾 小管轻-中度萎缩，间质纤维化伴炎细胞浸润。 2、肾小管间质病变积分 肾小管间质积分各组分别是Ⅰ组（0±0），Ⅱ组（7.60±1.67），Ⅲ组（2.92±0.67） 各组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。