米曲霉内切葡聚糖酶基因(AoEGLAI)在毕赤酵母中的表达研究及其酶学特性分析-生物学专业毕业论文.docxVIP

上 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 米曲霉葡聚糖酶基因（AoEGLAI）在毕赤酵母 中的表达研究及其酶学特性分析 摘 要 纤维素是生物界极其重要的一类碳水化合物,伴随着不可再生资源如煤炭、石 油等的日渐枯竭,对可再生资源纤维素的降解和利用逐渐地受到人们的重视。在自 然界的生物体，如细菌、真菌、动物体内，都存在纤维素酶，它是一类复合酶的 统 称 , 包 括 内 切 葡 聚 糖 酶 (Endo-1,4- β -D-glucanase), 外 切 葡 聚 糖 酶 (Exo-1,4- β -D-glucannase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)。其中，内切葡聚糖酶随机切割 纤维素多糖链内部的β-1,4-糖苷键，通过与外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作 用，水解大分子纤维素为葡萄糖并最终转化成乙醇，可用于食品、纺织、造纸、 饲料、中药成分提取等众多领域，在酿酒、石油开采等方面及生物能源工业都有 很好的应用。然而，由于天然微生物产生的纤维素酶活力不够高,且生产成本也较 高，所以通过基因工程手段来提高纤维素酶活性，已成为一个可以有效降低纤维 素酶生产成本的途径。 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为甲基营养型酵母的一种，它能够在以甲醇 作为唯一碳源和能源的培养基上进行生长。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系 统也是一种最为常用的甲基营养型酵母表达系统，它有着优于其他表达系统的一 些特点: 例如它可以经外源蛋白进行翻译后修饰、其自身分泌的背景蛋白较少， 糖基化程度比较低，易于增加基因拷贝数目，它对营养的要求较低，可以采用廉 价的培养基进行培养, 也可以进行细胞高密度发酵等。这些优点为内切葡聚糖酶 的工业化生产奠定了基础，同时，作为一种在现代分子生物学研究中极其重要的 模型, 巴斯德毕赤酵母越来越受到研究学者的关注。 近年来，随着微生物食品生物工程技术的不断发展，米曲霉(Aspergillus oryzae) 作为发酵工业和食品加工业的重要菌种，日益成为研究热点。2005 年，米曲霉 RIB40 (ATCC42149)的基因组测序工作由日本几家科研机构联合部分企业共同完成，该菌 株是研究米曲霉生理调控的模式菌株，测序结果表明米曲霉基因组有 8 条染色体。 米曲霉是一类产复合酶的菌株，能分泌多种酶类，如纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、 I 植酸酶等。本文根据 NCBI 数据库公布的米曲霉葡聚糖酶氨基酸序列及毕赤酵母的 偏爱密码子，通过 PTDS 方法和结构优化合成了用于甲醇诱导型毕赤酵母表达的米 曲霉葡聚糖酶(AoEGLAI)基因。 过程如下：首先将目的基因经大肠杆菌克隆并测序，测序正确后连接到 pPIC9K 表达载体上，通过电击转化到毕赤酵母 GS115 菌株，再采用葡聚糖酶活性鉴定、 SDS鉴定等方法，最终获得米曲霉葡聚糖酶表达的阳性酵母菌株。随后将获 得的毕赤酵母工程菌株进行扩大培养及诱导，获得重组葡聚糖酶，利用 DNS 法对 其酶学性质和动力学参数展开研究。 结果表明：重组葡聚糖酶的 Km 和 Vmax 值分别为 22.47 g/L 和 1.22 g min-1 L-1。 该酶最适 pH 为 3.0，最适温度为 50℃，在 30-45℃和 pH 4-8 范围该重组内切葡聚 糖酶可保持 90% 以上酶活力，温度超过 50℃时酶活性下降很快，70℃处理 10min 后其活性基本丧失，但在底物 CMC 存在时其热稳定性有很大的提高。重组酶混合 在 1mM 的金属离子溶液中处理，各离子对其活性无明显影响，而 10mM 的金属离 子 Cu2+、Ca2+、Zn+、Gr3+、Fe2+和 Fe3+对重组酶有激活作用，Mn2+对重组酶则起抑 制作用。该酶对胃蛋白酶(pepsin)抗性相对较差，对胰蛋白酶(trypsin)则有一定的抗 性。 近年来，国内关于纤维素酶基因克隆与表达的报道已不少，但在米曲霉产内 切葡聚糖酶方面的研究仍相对较少。为此，本文就来源于米曲霉的β-1,4-内切葡聚 糖酶的酶学性质展开研究，本实验研究结果表明，经过改造的葡聚糖酶基因可以 在毕赤酵母中高效表达，在酸性环境中其稳定性较好，为进一步探索酸性纤维素 在食品工业中的应用打下了一定的基础。 关键词：米曲霉； 内切葡聚糖酶；毕赤酵母；酶学性质 II Expression and Characterization of recombinant endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus oryzae in Pichia pastoris ABSTRACT Cellulose is an extremely important carbohydrate. By now, with the