雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析.docVIP

雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析 ［摘要］贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二菇赤霉 素生物合成途径上的关键酶，参与植物生长发育等重耍生物学过程。该文 根据雷公藤转录组数据设计特异性引物，采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯 酸氧化酶全长cDNA序列，并进行生物信息学分析；使用实时定量PCR (qRTPCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到TwKAO长度为1 874 bp, 编码487个氨基酸，蛋口相对分子质量5602 kDa,理论等电点889；经茉 莉酸甲酯(MeJA)诱导后，TwKAO基因相对表达量在12h达到峰值;经植 株组织表达分析证实，TwKAO基因在雷公藤的叶中表达量最高，根中最低。 该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因，并分析其mRNA表达特征，为深入 研究雷公藤生长发育以及祜类活性成分次生代谢研究奠定基础。 ［关键词］雷公藤；贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)；克隆；生物信息学 分析；表达分析 药用植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f系卫矛科木质藤本 植物，临床中多使用其根或根的木质部入药，具有抗炎、神经保护、免疫 调节、抗肿瘤等活性，可用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等免 疫疾病。近年来发现，雷公藤中重要的二菇类成分雷公藤甲素在抗肿瘤尤 其是治疗胰腺癌［12］方面具有显著疗效。由于其广泛的药理活性，对雷公 藤有效成分药理作用、生物合成等方面的研究得到越来越多的关注［35］。 赤霉素是植物牛长发育中必不可少的激素，参与植物牛长包括种子萌 发，茎伸长以及开花等过程。而赤霉素的生物合成过程中，从ent贝壳杉 烯、ent贝壳杉醇、ent贝壳杉醛到ent贝壳杉酸，再到ent7过羟基贝壳 杉烯酸等连续反应都是由CYP450催化而成［6］。贝壳杉烯酸氧化酶 (kaurenoic acid oxidase, KAO)参与从贝壳杉烯酸到GA12的反应过程 ［7］,其属于细胞色素P450中CYP88A亚家族，参与赤霉素牛物合成途径 中3步连续的催化反应［8］。目前，KAO基因己从小麦［910］,豌豆［11］, 梨［12］等植物中克隆得到，并研究其缺失对向FI葵矮小突变体的影响 ［13］。 雷公藤屮KAO基因尚未克隆得到，因此本研究以雷公藤悬浮细胞为研 究材料，克隆得到长度为1 874 bp的TwKAO基因，研究其在茉莉酸甲酯 (MeJA)诱导后240 h内基因的表达水平，并进行生物信息学分析，为进 一步研究雷公藤重要活性成分生物合成提供宝贵的基因资源。 1材料 11植物雷公藤悬浮细胞由首都医科大学中药资源与分子生药学实验 室继代保存。培养条件:05 mg?L-l 2, 4D + 01 mg?L~l KT+05 mg?L-l IBA+MS 液体培养基，25 °C, 120 r?min-l避光培养。 菌株及载体 Escherichia coli Trans 5 a 感受态细胞、pEASYT3 vector购自北京全式金生物技术有限公司。 仪器与试剂 VeritiTM96 孔梯度 PCR 仪，TF 7500 型 Real Time PCR System为美国Applied Biosystoms公司，318k型高速冷冻离心机为 SI GM A 公司；PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer?自 美国NEB公司；Fast Quant RT Kit (With gDNaso)＞琼脂糖凝胶回收试 剂盒、RNA纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，EastepSuper 总RNA提取试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，其他试剂为 国产分析纯。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序 服务由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。 2方法 21RNA提取与纯化使用CTAB法提取雷公藤悬浮细胞总RNA并依据RNA 纯化试剂盒说明书进行纯化，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。 22全长cDNA克隆与测序使用Fast Quant RT Kit将雷公藤悬浮细胞 总RNA反转录成cDNA,根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计全长特异性引 物 24TwKA0基因的诱导表达分析于雷公藤悬浮细胞继代培养12d后，使 用茉莉酸甲酯(50 nmol?L-l)诱导，设置对照组。于诱导后不同时间点 (0, 12, 24, 48, 72, 240 h)取样，每个吋间点设置4个平行样品。使 用EFLa基因作为内参基因，根据所得TwKAO序列设计实时荧光定量特异 性引物。提収雷公藤悬浮细胞总RNA并反转录成cDNA,进行TwKAO基因的 诱导表达分析。实时荧光定量反应体系:10 UL 2XSYBR green Mix, 0