利用锌指核酸酶敲除斑马鱼目的基因的实验体系的初步构建-发育生物学专业毕业论文.docxVIP

..--一一 原创性声明本”群明：所呈交的学位论文，是本^在导师的指导下，独立进行研 原创性声明 本”群明：所呈交的学位论文，是本^在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含钰伺翼祜!个人 或集体己型始髓姥髑过盼徘觅成果。对本文的哥f究作出重要剩{的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本扒殍担。 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学徽留、使用学住娩文自铐啶，同意学f重保留或 向国家有哭部门或加构送交澎蚊的复印件和电子版，允许说玟被查阅和惜阅； 本^、授权山东嗣眺留栏新渤跋盼翁鞭黼内容编入有嬲库j揣 索，可以采用影印、缩印或琪|f也．复制手段保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文姗周立遵铜雌见定) 』，0 论文作者签名：盛：曼．论文作者签名：玉翌IL导师签名：≤控炷日导师签名：迸垫查日期：丝生苎：丝期：盟 广 嚼 山东人学颂Ij牛业论文目 山东人学颂Ij牛业论文 目 录 中文摘要 ．1 英文摘要 ．．3 符号说明 ．．4 l前苦 ．．： ．6 1．1传统反向遗传学技术及其局限性 ．．6 1．2利用锌指核酸酶进行基闪敞除 ．．8 1．2．1锌指核酸酶的研究历程 8 1．2．2锌指核酸酶的结构特征 9 1．2．3锌指核酸酶的作用原理 ．．12 1．2．4锌指核酸酶的应用 ．．14 1．3册f砌基例简介 15 1．4研究思路及意义 ．15 2实验材料与方法 ．．16 2．1实验材料与仪器 ．16 2．1．1实验动物 ．．16 2．1．2主要实验材料 ．．16 2．1．3主要实验仪器 ．．18 2．2实验办法 ．18 2．2．1靶侮点的确定及锌指蛋白的设计 ．．18 2．2．2锌指蛋白编码序列的合成 ．．20 2．2．3锌指核酸酶装配 ．．26 2．2．4锌指核酸酶的表达和纯化 ．．31 2．2．5锌指核酸酶活性的体外检测 ．．35 2．2．6锌指核酸酶基J大】敲除质粒载体的构建 ．．37 2．2．7斑马鱼的饲养与繁殖 。42 2．2．8锌指核酸酶基冈敲除质粒载体的显微注射 ．．42 2．2．9基闪敲除结果检测 ．．43 3结果 ．．45 3．1靶位点及特芹性锌指蛋白序列 ．45 3．1．1 m帕序列 ．45 3．1．2肌f砌序列上的靶位点及特异性锌指蛋白的氨基酸序列 ．54 3．1．3编护j特异性锌指蛋白的核酸序列 ．．54 3．2编码锌指蛋白的核酸序列合成结果 ．55 3．2．1基冈合成的引物 一55 3．2．2编忙5锌指蛋白的核酸序列 。57 3．2．3编i{f，5锌指蛋白的核酸序列测序结果 一57 3．3锌指核酸酶编码序列 ．58 3．3．1 载体pET．Fok I．30a 58 3．3．2 表达载体pET-ZFNl．30a和pET-ZFN2．30a 一59 3．4锌指核酸酶表达和纯化结果 ．60 3．5锌指核酸酶体外活性检测结果 ．61 3．6锌指核酸酶基因敲除质粒载体 ． ．62 山东人学硕Ij毕业论文3．6．1 山东人学硕Ij毕业论文 3．6．1 5’端加上核定位信号及没切位点的锌指蛋白序列 ．．62 3．6．2带有核定位信号的锌指蛋白序列测序结果 一63 3．6．3锌指核酸酶基I大l敲除质粒载体 ．．“ 3．7斑马鱼基洲敲除结I果 65 3．7．1荧光观察与统计结果 ．．65 3．7．2基冈组提取 ．．66 3．7．3检测位点确定 ．．67 3．7．4检测位点扩增 ．．67 3．7．5测序质粒构建 ．．68 3．7．6测序结．粜 ．．68 4讨论 ．．70 4．1利用锌指核酸酶敲除斑马鱼目的基冈实验体系的确立 ．70 4．2利用锌指核酸酶敲除斑马鱼目的基闪实验体系的优化策略 ．72 4．2．1 靶位点选择的优化策略 ．．73 4．2．2连接物序列的优化策略 ．．73 4．2．3标记物的优化策略 ．．74 4．3利用锌指核酸酶敲除斑马鱼目的基冈的关键技术 ．74 4．3．1 Zinc finger tools应用jJ二锌指结构设计 ．．74 4．3．2 DNAWbrkS的使用 ．．76 4．3．3两步法基N合成 ．．78 4．3．4锌指核酸酶的体外表达和纯化 ～79 5结{念 81 6参考文献 ．．82 7致{射 ．．90 8硕+期间发表文章 ．．91 2 山东人学颀I：毕业论文利用锌指核酸酶敲除斑马鱼目的基因的实验体系的初步构建 山东人学颀I：毕业论文 利用锌指核酸酶敲除斑马鱼目的基因的实验体系的初步构建 中文摘要 斑马鱼因其个体小、易于饲养、性成熟周期短、体外受精和发育、易繁殖且繁 殖率高、胚体透明容易观察、便于胚胎操作等优势，现已广泛地应用于基因功能相 关研究。近年来在基因功能研究和疾病的基因治疗方面，基因组定点突变逐渐成为 反向遗传学的研