两亲性壳聚糖连接低分子量聚乙烯亚胺为骨架的肿瘤靶向转基因载体的构建-食品科学与工程专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 PAGE PAGE IV III III 效率的双功能肽 RGDC-TAT（命名为 R13）。最后，采用双功能肽 R13 修饰 PEI 衍生物 OTMCS-PEI，得到新型转基因载体 OTMCS-PEI-R13。 本文第一章介绍了聚乙烯亚胺与壳聚糖在转基因载体中的应用，包括 聚乙烯亚胺的结构特性、对其进行不同的修饰得到的各种聚乙烯亚胺衍生 物以及壳聚糖的结构特性、研究热点等。 第二章内容为 OTMCS-PEI-R13 的合成与表征。首先采用固相法制备双 功能肽 R13，并通过质谱测定其序列，HPLC 测定其相对含量，并采用酶联 免疫法检测 R13 与整合素 αvβ3 阳性的 Hela 细胞和 B16 细胞的亲和能力。 壳聚糖 CS 依次与正辛醛、N-甲基吡咯烷酮在一定条件下反应得到两亲性壳 聚糖 N-辛基-N-季铵化壳聚糖 OTMCS，进而采用三光气+琥珀酰亚胺法活化 OTMCS 并与 PEI 2KDa 连接形成 OTMCS-PEI 高分子量衍生物。最后通过 交联剂 SMCC 将 R13 按不 同摩尔 比 与 OTMCS-PEI 偶 联得到最 终产物 OTMCS-PEI-R13。各反应产物通过 IR 或 1HNMR 进行结构分析。结果表明， 成功合成了双功能肽 R13，其纯度达到 95%，同时，R13 表现出良好的肿瘤 细胞亲和能力。成功合成了两亲性壳聚糖 OTMCS，并采用三光气+琥珀酰 亚胺法活化 OTMCS 并交联 PEI 2KDa，最后成功采用 SMCC 法将 R13 与 OTMCS-PEI 偶联形成最终产物 OTMCS-PEI-R13。红外、核磁等结构表征 表明目的产物修饰度高且纯度好，说明合成方法稳定、可控。 本文第三章考察了 OTMCS-PEI 和 OTMCS-PEI-R13 的理化性质。通过 测定两种聚合物在 37℃下不同时间点分子量来评价其水解性能；使用激光粒度 仪和 Zeta 电位测定仪测定其粒径及表面电位；使用透射电镜观察其形态结构； 通过凝胶电泳阻滞分析考察其包裹 DNA 的能力及对 DNA 的保护能力；采用 MTT 法评价两种聚合物对 Hela 细胞、B16 细胞的毒性，并与 PEI 25KDa 和 PEI 2KDa 进行比较。结果表明，OTMCS-PEI-R13 在 37℃条件下可缓慢水解，大约 60 小 时水解为小分子聚合物。与 DNA 形成的复合物呈类球形，粒径约 150-250 nm， 电位适 中 。 OTMCS-PEI 与 DNA 质量 比为 0.6 时可将 DNA 完全 包裹， OTMCS-PEI-R13-l 与 DNA 质量比为 1 时将 DNA 完全包裹，OTMCS-PEI-R13-h 与 DNA 质量比为 3 时将 DNA 完全包裹，三者均具有较强 DNA 缩合能力。同时， OTMCS-PEI 可保护 DNA 抵抗 1100μg/mL 肝素钠、3 U DNase I/μg DNA 的 DNase I 及 50%血清的解离，OTMCS-PEI-R13 可保护 DNA 抵抗 300μg/mL 肝素钠、23.5 U DNase I/μg DNA 的 DNase I 及 50%血清的解离。以上结果表明 OTMCS-PEI 和 OTMCS-PEI-R13 均具有很强的 DNA 保护能力。与高分子量 PE（I PEI 25 KDa） 相比，OTMCS-PEI 与 OTMCS-PEI-R13 的细胞毒性显著降低，低浓度时与 PEI 2KDa 毒性类似，即使在高浓度时仍保持 60%以上细胞活度。 本文第 四章考 察了 OTMCS-PEI/DNA 、 OTMCS-PEI-R13-l/DNA 及 OTMCS-PEI-R13-h/DNA 复合物体内外转染。以 pEGFP-N2 绿色荧光蛋白质粒和 pGL3-Control 虫荧光素酶质粒为报告基因，考察两种复合物在 Hela 细胞和 B16 细胞中的体外转染能力。荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，生物/化 学发光仪定量检测虫荧光素酶表达情况。最后建立肿瘤模型，以 pGL3-Control 虫荧光素酶质粒作为报告基因，考察复合物在体内的分布和表达情况。结果表明， 随着 w/w 升高，转染效率也逐渐升高，三种复合物的转染效率均显著高于 PEI 25 KDa，尤其连接 R13 后，转染效率更大幅提高。体内试验表明，复合物在体内的 转染效率同样优于 PEI 25 KDa，偶联 R13 后，虫荧光素酶报告基因在肿瘤组织 中表达增强，表明 R13 可明显改善复合物在体内的分布，可知 OTMCS-PEI-R13 在体内具有较强肿瘤靶向能力。