链霉菌分化负调节基因nsda在抗生素高产育种上的应用-微生物学专业论文.docxVIP

链霉菌分化负调节基因nsdA存抗生案高产育种I。的应用链霉菌分化负调节基因nsdA在抗生素高产育种上的应用 链霉菌分化负调节基因nsdA存抗生案高产育种I。的应用 链霉菌分化负调节基因nsdA在抗生素高产育种上的应用 摘要 nsdA是本实验室首次发现的一个全局性负调控基因，对天蓝色链霉菌抗生素的 合成和产孢形态分化具有负调节作用。nsdA的中断菌株能够提前且超量产生放线紫 红素、钙依赖抗生素、次甲基霉素，同时产孢量也增多。本研究的目的是研究nsdA 基因在其它链霉菌特别是重要抗生素产生菌中是否广泛存在，并用于构建抗生素高 产菌株。 在本论文中，用天蓝色链霉菌nsdA片断为探针进行Southern杂交，在阿维链霉 菌NRRL8165、吸水链霉菌5008、白色链霉菌JA3453、金色链霉菌211、变铅青链 霉菌ZX64、链霉菌FR．008 DX600、吸水链霉菌10．22等7种链霉菌中都有杂交信 号；并且PCR扩增都有明显的特征带。表明这些菌株中都含有nsdA的同源基因。 变铅青链霉菌含有沉默的放线紫红素生物合成基因簇。对ZX64菌株的nsdA进 行PCR扩增及序列测定，结果表明该基因与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA有100％的 核昔酸序列一致性。用基于同源重组的原理中断ZX64的nsdA，抗性筛选获得中断 菌株WQ2，PCR实验从分子水平上证明W02染色体中的nsdA已被中断。与沉默 的野生型菌株ZX64相比，WQ2能够合成放线紫红素：在W02中引入野生型nsdA， 使互补菌株重新失去产抗生素能力。结果表明nsdA对变铅青链霉菌抗生素合成具有 负调节作用，中断nsdA能激活沉默的抗生素生物合成基因。 根据已测序的阿维链霉菌MA．4680菌株的序列设计引物，从阿维链霉菌 NRRL8165中PCR扩增出包括nsdA同源基因nsdA。。及其两侧序列的5．7kb的片段并 测序验证。接着构建了nsdA。。的中断质粒pilL214，把该质粒接合转移到阿维链霉菌 NRRLSl65中，筛选得到中断菌株WQ5．1和W05—2，PCR验证中断菌株中nsdA。， 基因已被正确中断。对中断菌株的发酵产物HPLC的分析表明中断菌株阿维菌素的 效价提高了大约30倍。 根据天蓝色链霉菌的序列设计引物，从吸水链霉菌5008中PCR扩增出包括nsdA 同源基因nsdAjg及其两侧序列的4．7kb的片段并测序。测序结果表明nsdAjg与天蓝色 链霉菌基因组序列具有86％核苷酸序列相似性。另外构建了中断质粒pilL202和 pilL213。但是不能成功的把中断质粒接合转移导入到吸水链霉菌5008菌株中，有 关接合转移系统有待进一步研究。 关键词：链霉菌分化负调控基因nsdA；放线紫红素：阿维链霉菌；吸水链霉菌：基 因中断 4 华中农业大学颂士学位论文Application 华中农业大学颂士学位论文 Application of NsdA，a negative regulator of Streptomyces differentiation in antibiotic breeding Abstract nsdA is a globally negative regulator gene first found by olLr laboratory．It negatively regulates antibiotics production and sporulation in Streptomyces coelicolor．S．coelicolor nsdA null mutants produce more actinorhodin，CDA，methylenomycin and spores than wild type strain The goal of this study is to test whether nsdA homologous gene is wildly existent in other Streptomyces species，especially producers of some important antibiotics， and whether it can be exploited in strain improvement． In this study．Southern blot using an nsdA fragment aS probe was carried out to test the existence of nsdA gene in S avermititis NRRL8165，S．hygroscopicus 5008，S．albus JA3453，S．aureofaciens 21 1，S．spp．FR