课件：五基因治疗.ppt

二、多重PCR 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。 DMD基因外显子缺失的检测 三、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR） 一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。 原理是，利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。 DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。 (1) 提取总RNA， (2)在逆转录酶作用下，以Oligo T 为引物，进行逆转录； (3)PCR反应，扩增cDNA的第一条链； (4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开； (5)找出不同处理间差异显示的条带，并回收， (6)克隆差异片段，差异片段可作为探针； (7)Northern 杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)对目的片段进行测序； (9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 反转录病毒：基因组是单链RNA，其单链RNA能编码反转录酶，在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA。 被整合到细胞基因组中的逆转录病毒序列称为原病毒(Provirus)，逆转录酶、整合酶 2 copies of RNA genomes in 1 virus. If 2 different but related viruses infect 1 host cell, heterozygous virus may be formed. This makes it easier to acquire cellular sequence. 出芽、芽伸长、病毒释放、病毒成熟 The production of a retroviral particle involves packaging the RNA into a core, surrounding it with capsid proteins, and pinching off a segment of membrane from the host cell. The release of infective particles by such means is shown in Figure 16.4. The process is reversed during infection; a virus infects a new host cell by fusing with the plasma membrane and then releasing the contents of the virion. 逆转录病毒颗粒的生产涉及到把RNA包装到核心蛋白里，外面围绕着衣壳蛋白，并从宿主细胞的质膜上出芽释放。这样释放感染性颗粒的过程表示在图19.4中。感染过程与此过程相反；病毒通过与质膜融合从而感染新的宿主细胞，然后释放病毒体的内含物。 逆转录病毒叫做正链病毒，因为病毒RNA自身编码蛋白质产物。正如其名字所暗示的，逆转录酶负责把基因组(正链RNA)转录成互补的DNA链。逆转录酶也催化双链DNA的后续阶段，它有DNA聚合酶活性，能从RNA的单链逆转录来合成双螺旋DNA，双螺旋DNA中的第二条链叫正链DNA。作为此活性的必需的功能，该酶有RNA酶H的活性，可以降解RNA-DNA杂化物中的RNA部分。所有逆转录病毒的逆转录酶有相当大的氨基酸序列的同源性，有些其他的反转录子有类似的同源序列。 抗HIV-l的作用 ：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而实现抗病毒作用 反义RNA的应用（二） tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子 Tat蛋白,它能增强HIV-1基因转录起始和延伸的效率. TAR序列是TAT激活HIV基因表达所必需的效应元件。处于LTR的R区内。 Tat结合到TAR的茎环结构上。 Tat可与RNA结合因子一起以复合体形式结合在转录物的TAR序列上，并与装配在启动子处的转录起始复合体作用， 这种作用导致TFⅡH的激酶活性被激活，结果RNA聚合酶Ⅱ的羧基端结构域 (CTD)实现磷酸化，使得RNA聚合酶前进，完成HIV转录单位的阅读，实现HIV蛋白的大量合成。 抗HIV-l策略 在逆转录病毒启动子LTR之后连接反义tat与多聚TAR的构建物(LTR-25TAR-AS-TAT) ，具有反义tat及TAR诱饵的双重作用 gag是HIV-1的结构基因，编码p24