利用农杆菌介导法将pta和sb401基因导入甘蓝型油菜的研究-作物遗传育种专业论文.docxVIP

摘要 摘要 油菜是一种适应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大的油料作物，我国60 ％以上的人口食用菜油，我国油菜面积和总产居世界首位，然而其单产和品质却远远 低于加拿大及其他欧洲国家。在油菜生产中，病虫害的发生是油菜高产稳产的限制因 子之一。另外，在我国由于常规油菜芥酸和硫代葡萄糖甙含量较高，严重影响了菜籽 油的品质和菜籽饼粕的开发应用。因此，推J“和普及双低油菜品种、改良品种的抗病 虫性并提高菜籽蛋白营养品质，对我国油菜产业的发展将具有重要的意义。 基因工程技术的发展，打破了传统育种的局限，可以同时将含目标性状的一个或 多个基因导入受体作物基因组，达到对农作物一个或多个性状的改良。从而为作物育 种和改良开拓了一条崭新的途径。 由于农杆菌介导的植物转基因方法具有操作简单、转化效率高、较少的拷贝数及 整合机制相对简单等优点，而被植物转基因工作者广泛推崇。但农杆菌转化法是一个 细菌和愈伤组织共同作用的复杂过程。凡是涉及到细菌活性或愈伤组织状态的因素都 可能影响其转化效果。迄今为止，油菜农杆菌转化系统仍存在不少问题，国内外的油 菜转基因报道中多以某一特定品种为转化受体，其结果不具有普遍性。本研究利用农 杆菌介导法将构建于同一表达载体的抗油菜蚜虫等同翅目害虫的半夏凝集素p胁基因 和富含赖氨酸的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401转入甘蓝型双低油菜中，主要 成果如下： 1．选择四川目前推广的中双6号等8个甘蓝型双低常规油菜品种作为农杆菌转化受 体材料，设置了8种激素配比组合，通过选择基本培养基、无菌苗的苗龄、下胚 轴切段长度等因素探讨其对植株再生的影响，确定了以MS+6一Bhlmg／L+2．4-Do．5 mg／L培养基作为下胚轴分化的预培养基，以MS+I～4mg／L 6_BA十0．05～0．4mg／L NAA为分化培养基，初步建立了不同油菜品种下胚轴的高效再生体系。应用该再 生系统，中双6号等四个品种的分化率可达40．67～69．67％。 2．在建立高效再生系统的基础上，进一步建立了油菜下胚轴的遗传转化系统。结果表 明，取5～6d无菌苗下胚轴，切成0．5cm小段，在附加1．Omg／L 6-队和0．5mg／L 2．4-D 的№培养基上对下胚轴进行2d的预培养；在00600=0．3时离心收集农杆菌菌体并 用Ms液等体积重悬后，将下胚轴放入悬浮液中浸染30～60S，取出吸去多余菌液 后于共培养基(附加100 u m／L乙酰丁香酮的预培养基)上进行30～42h的与农杆 菌共培养：用cb200mg／L+cef400mg／L洗菌，洗菌后的下胚轴进行一定的干燥处理， 并在6一BA l～4mg／L和NAA 0．05～O．4mg／L配比组合的分化培养基上进行6～7d 的脱菌培养；再进行筛选分化培养；对抗性芽根据不同品种选择适合的生根培养基 进行生根培养。实验证明该再生转化系统选材方便，转化相对简单，各单因素的作 用效果明显。 3．应用上述遗传转化体系，将构建在同一载体(pDBl3PS)T-DNA上的pta和sb401基因 导入油菜品种中双9号、中双7号、中双6号、川油18中，共获得T79株L代转基因潮 导入油菜品种中双9号、中双7号、中双6号、川油18中，共获得T79株L代转基因潮 霉素抗性再生植株。 4．提取T水转基圉植**DNA，用选择标记基因hyg弓I物经PcR扩增，有26株扩增出与 阳性对照相同的目标片段(832bp)，随机抽取5株慨阳性株，以目的基因pm、sb401 引物经PCR扩增，均得到了417bp、910bp大小的扩增片段，初步表明外源基因已整合 进了油菜基因组中，进一步Southern杂交检测，表明外源基因已插入到油菜基因组中， 且多数为单拷贝插入。 5．对T。代转基因植株性状、初花期、抗虫性、结实性等田间表型进行观察记载，并 已收获T0代种子，为进一步的遗传研究奠定了基础。 关键词：甘蓝型油菜，根癌农杆菌，pta+sb401基因，遗传转化系统，分子检测 ABSTRACTRape ABSTRACT Rape is one of the most important oil crops with strong adaptability．extensive application，high economy worthiness and great developmental potential．There are more than 60％of people having rapeseed oil in our country,the cultivated area and gross production ofrapeseed oil both occupy the first class in the world，but the