利用拟南芥遗传资源构建植物人工染色体-生物化学和分子生物学专业论文.docxVIP

孙砚 孙砚 利用拟南芥遗传资源构建植物^工染色体 摘 要 真核生物中DNA与多种特异的蛋白质结合组成遗传物质的载体——染色体。在 细胞分裂过程中，染色体首先进行DNA复制，产生染色单体并排列于赤道板上，然 后在纺锤丝的牵引下染色单体两两分离，移向细胞两极。为了保证细胞分裂周期中 染色体行为的正确和其结构的稳定，生物必须有一套复杂、有效、有条不紊的机制 做保障。在这一保守系统中，染色体上的着丝粒、端粒和复制起点是三个关键成分。 1983年，Murray和Szostak在大肠杆菌质粒pBR322中加入酵母的着丝粒，ARS 序列及四膜虫核糖体RNA基因rDNA(Tr)术端序列，构建了长度为10．7kb的短着 丝粒的环状质粒。用这一质粒转化酵母菌，质粒变为线状，成为第一个酵母人工染 色体(Yeast Artificial Chromosome YAC)。YAC的成功构建为我们理解着丝粒、 端粒等功能组分在酵母染色体中的作用提供了依据，同时也对有丝分裂、染色体断 裂机制的研究、细胞同步研究和染色体进化等方面的研究有着重大的意义。不仅如 此，YAC的出现还为基因克隆提供了新型载体，为构建高等生物的基因组文库提供 了技术支持。YAC虽然在文库构建、基因克隆和细胞分裂机制的研究等领域起了巨 大的作用，但YAC只能在低等单细胞生物酵母中稳定存在，难以用来转化高等生物。 人类人工染色体(HAC)的组成成分都可以是来源于人类自身的基因组，因此可以同 细胞中正常的染色体一样分裂复制，稳定遗传并且不会对受体产生毒害，所以通过 应用HAc有可能解决基因治疗中的难题。1997年，美国的Case Western Reserve 宣布构建成功第一代HAC。 在植物细胞中构建人工染色体将为植物染色体的结构和功能以及染色体的各必 须组分的研究提供有效的工具和手段。成功构建的植物人工染色体也可以作为一种 新型的载体用来克隆和转化长达几百Kb到一个Mb的外源DNA进入植物细胞。因为 拟南芥的全基因组测序已经完成，而且拟南芥含有所有绿色植物中最完整最连续的 着丝粒区的己知序列，所以我们选用这种模式植物作为基础构建植物人工染色体。 我们通过PCR和序列分析，选择了含有拟南芥着丝粒区178bp串连重复序列的YAC 克隆作为构建人工染色体的基础，同时也克隆了拟南芥的端粒和ARS等序列。拟南 芥的端粒是利用端粒的重复序列进行无模板的PCR扩增得到的；约2000bp的ARS片 段是从拟南芥的BAC克隆Tt4A4中用限制性内切酶口a，切下，然后亚克隆到通用载 体Pbluescript上。 为了构建植物人工染色体，我们构建了可以和含有着丝粒序列的YAC载体的左 臂和右臂进行同源重组的质粒载体。与右臂同源重组的载体包含了端粒，用于在酵 母中筛选的G418的抗性基因kanMX4和用于与YAC DNA同源重组的TRPI基因片段； 牛【}】农业人学顺I：学位论艾与左臂同源重组的载体包含了端粒，用于在酵母中筛选的ABE2基因，用于在植物 牛【}】农业人学顺I：学位论艾 与左臂同源重组的载体包含了端粒，用于在酵母中筛选的ABE2基因，用于在植物 中筛选的GFP5基因，用于同源重组的URA3基因片段和ARS片段。这两个载体都 被转入含有YAC克隆的酵母菌株ABl380，在酵母细胞中完成了与YAC克隆的同源重 组，从而使拟南芥的着丝粒区的两端都与端粒序列连接起来，在酵母细胞中形成了植 物人工染色体的雏形。用脉冲电泳将经过同源重组的修饰的YAC克隆分离出来通过 脂质体转化植物的原生质体，希望得到在植物细胞中稳定存在的植物人工染色体。 孙说 孙说 利用拟南芥遗传资源构建植物人工染色体 Abstract ’[he construction and introduction of plant artificial chromosomes into plant celis would be an effective way to understand the essential elements necessary for maintaining chromosome function and structure in plants．The successfully constructed artificial chromosome WOUld alSO can be used as a new vector to introduce chromosome segments of hundreds Kb to Mb length into plant cellS．Because of its fully sequenced genome and the most complete， contiguous