利用10Fn3噬菌体库筛选RON胞外段结合蛋白-生物学、细胞生物学专业论文.docxVIP

SCREENING OF BINDING-PROTEIN OF RON FROM PHAGE LIBRARY BASEED ON 10FN3 SCAFFOLD A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Yanmin Si Supervisor: Prof. YuanFang Ma A.P. FengTao Liu May, 2015 ` I I II II 摘 要 背景 巨噬细胞刺激蛋白（Macrophage stimulating protein,MSP）受体酪氨酸激酶（Recepteur d，origine naetais，RON），是酪氨酸激酶受体亚家族成员之一，通常在上皮细胞、单核 巨噬细胞、粒细胞、肺、骨髓等多种正常细胞中均有表达。研究表明，RON 的异常表 达与多种细胞的恶性转化、肿瘤的侵袭等有很大的关系，因此抑制 RON 的异常表达对 于癌症的治疗具有重要的临床意义。随着细胞生物学的发展，已研究制备出了抗 RON 的单克隆单体。但由于该单克隆抗体分子质量比较大而难以进入组织发挥作用、来源于 免疫小鼠而在人体内易发生免疫排斥反应等缺点，限制了其在临床上的应用。随着噬菌 体展示技术的快速发展，利用该技术制备的人源化的以及全人源的抗体即克服了鼠单克 隆抗体异源性的缺点，又保留了其均一性、特异性强的优点。 虽然噬菌体抗体库的发展为人源抗体的制备提供了新思路，但利用该技术制备的抗 体其分子量依然很大、结构相对复杂、需经过一定的修饰（糖基化，加入二硫键等）才 能发挥功能。因此，利用与抗体功能类似的小分子蛋白为骨架构建噬菌体随机多肽库， 并利用噬菌体展示技术从中筛选出与靶标分子结合的高亲和的小分子多肽已经成为人 们制备新型抗体的新方法。 自然界中存在多种骨架蛋白，其二级结构具有与重要蛋白相互作用的活性位点，如 环状(loop)结构、α-螺旋或 β-折叠等，具有这些结构的骨架蛋白暴露在外边的某些碱基 组成的结合位点与抗体的互补决定域(Complementarity Determining Region，CDR)具有相 似功能，使得这些骨架蛋白具有了构建随机多肽库的可能。其中骨架蛋白第十人纤维素 类型 III 域（The tenth human fibronectin type III domain，10Fn3)就是一种常见的骨架蛋白， 其在人总蛋白中约占 2%，含量比较高，在细菌噬菌体中也有发现。因为 10Fn3 结合了 多种用于治疗用分子的特征而在 1998 年第一次被提出作为支架构建噬菌体随机肽库。 与其他骨架相比，10Fn3 具有免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）样结构域，并且在 N 端和 C 端存在能够与大分子结合的 β-折叠样非连续循环结构。此外疏水核心的 Ig 样域 提供了一个稳定的框架结构，使 10 fn3 具有较高的热稳定性(Tm 约为 88℃)。重要的是， 与可变的 Ig 相比，作为一种单体、缺乏稳定的半胱氨酸残基转录后修饰、在细菌中快 速高效表达的 10Fn3，其结构是比较稳定的。 在本实验中，我们选取了 10Fn3 作为支架，并将 BC 和 FG 循环结构中的氨基酸随 机化，依此构建了限制性的构象型随机肽库，并利用噬菌体展示技术，从中筛选出了与 RON 结合的高亲和力小分子蛋白的阳性克隆。 目的 构建以骨架蛋白 10Fn3 为基础的噬菌体随机肽库，并从该随机多肽库中筛选出与 RON 胞外段结合的高亲和力蛋白的阳性克隆。 方法 1.应用 RT-PCR 技术从乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中钓取 RON 细胞外段区域的基因。 2.分别构建 RON 细胞外段的克隆载体和表达载体。 3.采用瞬时转染的方法，将表达载体转染进 293T 细胞，收取上清液并纯化出 RON 细胞外段基因表达的蛋白。 4.通过重叠延伸 PCR 获得以骨架蛋白 10Fn3 为基础的噬菌体随机多肽库的基因，并 将其通过酶切位点 SfiⅠ和 NotⅠ与表达载体 pCantab5E 连接。 5.电转化入大肠杆菌 XL-Blue，建立初级噬菌体随机肽库。菌液 PCR 和挑取阳性克 隆并送公司进行测序，分别鉴定构建的噬菌体随机多肽库的插入率和多样性。 6.分别包被 10μg/ml、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL，0.63μg/mL,0.31μg/mL 和 50μg/ml、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，3.13μg/mL,1.56μg