桑树秋末冬初绿枝扦插生根的理化与转录组分析及鉴定-特种经济动物饲养专业论文.docxVIP

江苏科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： (1)保密□，在 年解密后适用本授权书。 (2)不保密□。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 2012 年 月 日 2012 年 月 日 摘要 摘要 摘 要 桑树具有顽强的生命力和适应性，生命期长，容易成林，不仅可绿化环境， 防风固沙，涵养水源，净化空气，收到良好的生态效应，还可以取得较高的经 济效益。通过对桑树扦插生理学和转录组学的研究为桑苗快速繁育技术的创新 提供理论支撑，加快优良桑树品种的推广应用，对提高桑园的质量和产量具有 重要的意义。 通过对秋末冬初桑树绿枝扦插进行相关生理生化指标分析桑树扦插生根的 生理机理；利用 Solexa 高通量测序构建了秋末冬初桑树绿枝扦插生根过程中的 4 个转录组数据库，通过分析大量的测序结果，筛选出相当多差异表达的基因， 揭示了生根过程中转录组水平的复杂的调控网络。并对在扦插生根过程中显著 差异表达的基因 MaGH3.6 的进行基因的克隆、表达模式的分析、系统发生分 析和功能验证。 主要实验结果和结论如下： 1. 可溶性糖和可溶性蛋白的含量在扦插生根过程总的趋势是处于下降的 趋势，但在扦插后期，可溶性糖的含量逐步回升。在扦插前期， IAAO（吲哚 乙酸氧化酶）的活性先显著上升后下降，中期活性变化不显著，后期吲哚乙酸 氧化酶活性逐渐上升并维持在较高活性水平。POD（过氧化物酶）呈现前期先 逐步上升后下降，中期变化不大，后期先上升下降的趋势。PPO（多酚氧化酶） 的活性在整个扦插过程中，呈现“U”型变化。 2. 通过 Solexa 高通量测序，构建了 4 个转录组数据库：S1，S2，S3 和 S4。 所得的原始序列经过去除低质量区域、de novo 拼接，分别得到 69058, 69087, 66557 和 66556 个 contig（序列片段）。对所得 contig 与 UniProt 蛋白数据库进 行 blastx 比对，进行蛋白功能注释，4 个数据库分别有 39504 (57.20%), 39497 (57.17%), 31868 (57.17%) 和 23837 (35.81%)有明确的蛋白功能注释。为了解各 个发育阶段之间的差异基因表达情况，根据基因的表达量 RPKM 值对 contig 进 行筛选，共获得 332（S1vs.S2）, 6381（S2vs.S3）和 842（S3vs.S4）个差异基 因,并对获得差异基因进行 GO 和 KEGG 功能富集。根据差异基因和 GO 和 KEGG 功能富集，详细比较了每个发育阶段之间的差异表达基因，结果表明： 差异明显的基因主要可分为：碳代谢和能量代谢，植物激素信号转导，细胞分 化、增值和细胞周期等 3 类。为验证测序数据库的有效性，随机选取 9 个基因 进行 qRT-PCR（荧光实时相对定量 PCR）验证，结果表明数据库数据与 qRT-PCR 结果基本一致，测序构建的 cDNA 文库数据准确有效。 I 江苏科技大学农学硕士学位论文 江苏科技大学农学硕士学位论文 3.从桑树茎部皮层克隆了一个桑树 GH3（gretchen hagen3）基因，并将其 命名为 MaGH3.6（GenBank 登录号: KC349982）。生物信息学分析显示该基因 编码 611 个氨基酸残基，蛋白质分子质量为 68.87 kD，无跨膜区域和信号肽序 列，而且蛋白质序列相当保守。半木质化和木质化的桑树插穗经 NAA（萘乙酸） 和 IAA（吲哚-3-乙酸）诱导处理后，通过荧光实时定量 PCR 检测到插穗皮层 MaGH3.6 的表达水平在 0.5 h 内急剧增加，并随着时间延长呈逐渐增高趋势， 其中 NAA 诱导处理组 MaGH3.6 的表达量明显高于 IAA 诱导处理组。利用 Solexa mRNA 测序构建的 cDNA 文库数据分析表明，MaGH3.6 在桑树扦插后 期根原基和根状突起形成阶段的表达量显著下降。研究结果提示 MaGH3.6 可 由 IAA 和 NAA 诱导上调表达，推测该基因的表达量下降可能会引起 IAA 的含 量增加，继而促进插穗不定根的形成和发育，初步认为该基因在桑树扦插生根 过程中扮演重要的角色。 关键词：桑树；扦插；生根机理；solexa 高通量测序；转录组；MaGH3.6 基因 II AB ABSTRACT PAGE PAGE IV ABSTRACT With long life t