鲤均一化全长cDNA文库构建、大规模测序及信息学分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 I I 摘 要 鲤鱼(Cyprinus carpio)，原产于欧亚大陆，是世界上重要的水产养殖鱼类。为进一步分 析研究鲤鱼转录组数据及其功能基因，我们构建了鲤均一化全长 cDNA 文库。本研究以 1 龄雌性鲤鱼的八种组织为材料，包括血液、鳃、卵巢、肝胰脏、头肾、体肾、心和脑组织， 利用 Cap-trapper 法，制备成全长 Uncut cDNA 原始文库。对原始文库进行检测，文库总克 隆数（CFU）为 6.4×106，重组率大于 95%。采用基因组 DNA 饱和杂交原理，对文库进行 均一化处理，从而构建了鲤鱼均一化的全长 cDNA 文库，CFU 为 2×105，重组率大于 95%， 插入片段平均长度大于 1.0kb，全长比例大于 90%。qPCR 检测表明，文库均一化后，β-actin 丰度相对于均一化前降低了 87 倍。 对均一化后的文库随机挑取 43008 个克隆，利用 M13F(-20)通用引物进行 5’端测序， 成功测序并得到 29779 条序列。序列处理后聚类拼接，获得 15116 条非重复序列（unigene）， 并提交至 NCBI 数据库。对得到的 unigene 进行长度分布及 GC 含量分析，序列长度主要 分布在 300bp-700bp 间，平均长度为 540bp；GC 含量分析表明鲤鱼基因 cDNA 序列中 GC 含量为 45.53％。基于本地 Linux 平台，使用 BLASTX 与无冗余蛋白数据库（NR）进行比 对分析，对 8437 条序列进行了注释，包括分子功能、生物学过程和细胞组分三个层次, 其 中细胞组分分为 13 个部分，分子功能分为 12 个部分，生物学过程分为 22 个部分。 从本文库筛选出 3 个 Rab1a 基因，分别为 Rab1a-1、Rab1a-2 和 Rab1a-3。应用鲤 BAC 文库对 Rab1a-1 和 Rab1a-2 进行全长测序及信息学分析，绘制出基因结构图；随后，对它 们的蛋白二级及三级结构进行比对作图，并构建系统发育树；最后，分析了 Rab1a-1 和 Rab1a-2 在不同组织的表达，以及低氧条件下它们表达的差异并对功能进行初步研究。 关键词：鲤鱼均一化全长 cDNA 文库；测序；信息学分析；Rab；差异表达 Ab Abstract II II Abstract The common carp (Cyprinus carpio) is a widespread freshwater fish of eutrophic waters in lakes and large rivers in Europe and Asia. To provide reference sequences for transcriptome analysis and assist in differentiating duplicated gene copies, a full-length cDNA library of common carp (Cyprinus carpio) was constructed via Cap-trapper method. mRNAs from eight tissues of an adult female common carp, including blood, gill, ovary, liver, head kidney, kidney, heart, and brain, were used for library construction. Total number of colony-forming units (CFU) of the primary full-length cDNA library was calculated to be 6.4×106. After normalization with genomic DNA, the redundancy of the normalized cDNA library was reduced by 87 folds. CFU of the normalized cDNA library was 2.0×105, which was enough to cover all the common carp genes and their potential duplicates. The average insert size was estimated to be 1.0 kb with a recombination of about 100%. RandomLy selected 43008 cDNA clones were sequenced from 5