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核酸的体外扩增 Polymerase chain reaction (PCR) PCR的原理 •PCR是一种利用DNA变性与复性原理在体外进行特定DNA 片段高效扩增的技术，它可以在一个简单的试管中反应， 用极少量基因组DNA作模板，在一对引物介导下，通过聚 合酶作用，在数小时内即可将所需特异性DNA扩增至2 n倍。 •PCR 的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR的基本步骤 •PCR三步曲 —变性：94°C，30sec —退火：45～55°C，30sec —延伸：72°C，依扩增 片断大小决定时间，一 般按2kb/min计算 指数扩增 PCR的特点 •特异性强： •灵敏度高： PCR产物的产量是以指数方式增加的，能将皮克 (pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(µg =10-6)水平 •简便、快速： PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应 PCR反应五要素 • 引物 •DNA聚合酶酶 •dNTP •模板 •缓冲液和Mg2+ PCR 引物 •要扩增模板DNA ，首先要设计两条寡核苷酸引物，就是 两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物 间距离决定扩增片段的长度，引物的5’端决定扩增产物 的5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位 置和结果的关键，因此，引物设计更为重要。 • PCR 引物的要求 —长度：15～30个核苷酸 —碱基分布随机 — 引物内、引物间不应有互补序列 — 引物与非特异扩增区无同源性 —3’端必须互补，但5’端可游离 PCR 引物的设计 •不少于16 bp，不超过30 bp ，最佳20～24 bp —可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点 或启动因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要。 •两个引物间不发生互补，特别是在引物3’端 —即使无法避免，其3’端互补碱基也不大于2个碱基，否则 易生成“ 引物二聚体”或“ 引物二倍体” • G+C）%含量引物的组成应均匀 —尽量避免含有相同的碱基多聚体，两个引物（G+C）% 含量应尽量相似。 •引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构 引物在PCR反应中的浓度 •一般在0.1～1 μM之间。 •浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。 •一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以 完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。 •退火温度 — 引物退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强， 但扩增效率下降；温度低产量高，但非特异性产物增加 —根据引物（G+C）%含量推测退火温度Ta ，比引物解链温 度Tm低5°C ，Ta = Tm - 5°C = 4(G+C) + 2(A+T) -5°C —在典型的引物浓度时，退火反应数秒即可完成 •引物延伸温度 —取决于DNA聚合酶的最适温度，一般70～75°C 。 —在72°C时DNA聚合酶合成速率可达35～100个核苷酸/秒。 每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、 pH值、盐浓度与DNA模板的性质。 —应根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度 寡核苷酸（dNTP） •dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq DNA聚合酶活性，且易 产生错误掺入 •低浓度dNTP可减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误 掺入，但会降低反应物的产量。 •PCR常用的浓度为50～200 μM ，不能低于10～15 μM •四种dNTP的浓度应相同 任何一种浓度偏高或偏低会诱导聚合酶的错误掺入， 降低合成速度，过早终止反应。 DNA聚合酶 •Taq DNA聚合酶 —典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/反应 —酶量过多会导致非特异产物的增加 4个碱基会有1个错误碱基掺入