细胞工程原理与技术实验计划.docVIP

《细胞工程原理与技术》实验计划 实验班级：07级 指导老师：魏海明 吕新怀 郑晓东张晓龙金晶 实验室负责人：吕新怀 xhlv@mail.ustc.edu.cn, 3600453 实验1 HL-60细胞的培养、传代、复苏和冻存 1 1、HL-60细胞的培养与传代 1.1实验分组 83人分3大组进入万级净化细胞间，每大组27, 27, 29人,分9个小组,每小组人， 实验材料准备及实验操作以小组为单位。 1.2实验材料 HL-60细胞，无菌完全RPMI-1640培养液，无菌离心管，无菌吸管，无菌培养瓶，离心机，倒置 显微镜，超净工作台，C02培养箱等。 1.3实验方法 HL-60细胞为悬浮细胞生长的细胞，可在完全RPMI-1640培养液中培养，该培养液由90%不完全 1640培养液［RPMI-1640液95亳升；0. 1M丙酮酸钠1毫升；0.2\1谷氨酰胺 1亳升；1\1 Hepes 1亳升；7.5% NallCOs 1亳升；青霉素、链霉素（各1万单位）1亳升］和10%灭 活胎牛或新主牛血清。传代时不必釆用酶消化法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。通常釆用离 心方法传代，即将细胞连同培养液一起转移到离心管内，离心800rpmx5min,然后去除上清，加新的 培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。根据细胞数量，可采用1瓶传3 瓶或其它比例传代。 2 2 HL-60细胞的冻存 2.1原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰品，能导致细胞内发牛?机 械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加 入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在一130°C 以下的低温中能减少冰品的形成。为了避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有 限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。目前常 用的保护剂为二甲亚砚（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 2试剂和器材 2.2.1器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管）、离心管、吸管、离心机等。 2.2.2试剂：0. 25%胰酶、RPMI-1640培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）。 2. 3冻存液配制 培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好 后4°C下保存。有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下： *包含10%甘油的完全培养基， *包含10%二甲基亚飒（DMS0）的完全培养基， *50%细胞条件培养基和50%含有10%甘油的新鲜培养基，或 *50%细胞条件培养基和50%含有10%二甲基亚飒的新鲜培养基。 对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是： *50%细胞条件无血清培养基和50%包含有7. 5%二甲基亚砚的新鲜无血清培养基或 *包含有7. 5%二甲基业飒和10%细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。 3方法与步骤 2.3. 1消化细胞（贴壁细胞），将细胞悬液收集至离心管中。 2.3.2 1000 rpm离心10分钟，弃上清液。 2.3.3沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5X107ml左右。 2.3.4将悬液分至冻存管中，每管51。 2.3.5将冻存管口封严。如用安甑瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 2.3.6贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 3.7按下列顺序降温：室温一4°C （20分钟）-冰箱冷冻室（30分钟）一低温冰箱（一30￡ 1 小时）一气态氮（30分钟）一液氮。 2.4注意事项 操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的 液氮能用1?1.5月。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 3冻存细胞的复苏 3冻存细胞的复苏 （第二周〉 冻存细胞比较脆弱，要求轻柔的操作。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的一5? 0°C,细胞仍能生长，活力受损不大。冻存细胞融化后，应当直接加入完全生长培养基屮。如果细胞 对冻存剂（DMSO或廿油）特别敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。冻存过程 中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 1取出贮存细胞，37 °C水浴屮快速融化。 3.2把1到2 ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。 3.3以大约800 rpm离心2到3分钟,弃去上清。 3.4在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。 3.5细胞铺板，细胞接种应该至少为3X1（/活细胞/ml。 实验2流式细胞仪原理及细胞凋