神经解剖学的研究方法.ppt

cDNA探针：特异性强，简便。为双链，使用前需加温，而且存在退火与mRNA竞争问题 RNA探针：比cDNA困难，为单链，灵敏度更高 寡核苷探针：制备容易，利于透入组织，但因为短，与RNA结合不牢固 探针标记物：有同位素标记和非同位素标记，常用的为地高辛-抗地高辛抗体法。 受体和转运体都是蛋白 使用免疫组织化学进行定位 形态学研究和功能学研究结合 常用方法： 2-脱氧葡萄糖法(2-DG): 利用14C，常用于定量测定大脑局部葡萄糖的消耗情况，但解析度低，费用高。 2. c-fos（Fos）法： c-fos是一种原癌基因，属于即刻-早期基因家族。 许多刺激下，不同的第二信使导致神经元内c-fos的表达增强，形成fos的mRNA，由其翻译成的Fos蛋白与另一即刻早期基因c-jun所产生的Jun蛋白构成二聚体，立刻转移至核内，调节靶基因的表达，引起细胞的一系列反应。 c-fos表达增加仅说明在特定条件下，有关神经元的活动发生了变化，但其活动的性质和结果可以是多种多样的。 c-fos反应很快，神经元收到刺激后，胞体中的mRNA很快到达峰值，1~2小时后恢复，蛋白稍晚，1小时后出现明显反应，2小时到达峰值，具体看实验情况。 3. 细胞色素氧化酶法 细胞色素氧化酶位于神经元的线粒体中，是提供能量的重要酶。 变化较慢，检出的是由某种慢性刺激所致的细胞氧化活动维持相对稳定的一种状态。 4. pERK法 ERK和MAPK的信号传导通路 许多刺激可以使脑内pERK1/2发生快速变化，使用抗体对变化水平进行检测，能反映参与活动的神经元的定位分布及其变化规律。 主要应用： 细胞间通讯研究 免疫荧光定量定位检测 细胞膜流动性的测定 细胞内离子分析 LSCM图像分析功能：细胞CT 控制生物活性物质的作用方式 激光显微外科手术台 光陷阱技术 CT，MRI和PET-CT 超高分辨率共聚焦显微镜 双光子显微镜 等等其他技术 霍乱毒素的B单位（CTb）无毒性，为受体结合单位。是一种灵敏的顺行、逆行和跨节标记的追踪剂。 与PHA-L步骤基本相似，可电泳和压力注射导入核团，分解慢，术后动物存活3~7天 可以与免疫组织化学方法结合，特别使用荧光素二抗时，CTb具有几乎所有荧光追踪剂的性能。 有与FITC和Rhodamine结合形式的追踪剂。 1977年，Kuypers及同事发现荧光素（fluorescent substance）可被神经末梢摄取并轴浆逆向运输 荧光素在一定激发波长的光照下，能以一定发射波长发出一定颜色的荧光，每一种都有各自的激发波长和发射波长，发射波长决定发出的颜色。 一般用于逆行追踪，有些特殊的可用于顺行。 多数标记胞质，少数仅标记细胞核，如nuclear yellow、diamidino yellow等 可在脑内进行2种或3种标记。 亲脂碳花菁染料：可标记活细胞和固定组织细胞，可用于细胞膜结构和动态变化的研究。活薄片培养时，可在实时动态显微录像术下观察轴突的发育等。 荧光素葡聚糖胺类追踪剂：如TMR-DA。 荧光微球类追踪剂：不同颜色的荧光素标记聚苯乙烯或乳胶微球制成。对组织无损伤，无毒性，光照耐受好，时间长(至少2年以上）等。 以神经营养性病毒为主，如单纯疱疹病毒、假狂犬病毒、腺病毒、禽病毒、弹状病毒等等。 病毒追踪可逆行从一个核团到另一个核团，可在神经元中增值，在一定时间后可以强标记。 近年有新型的将绿色荧光蛋白(GFP)重组到病毒中制作的基因重组病毒 局限性： 浓度依耐性，对神经元的毒性并导致神经元死亡。 星形胶质细胞和巨噬细胞会吞噬死亡的感染细胞，并在标记神经元周围聚集，限制病毒扩散。 需要预防和避免感染。 当神经元的轴突被损伤后，在损伤轴突的近侧端和远侧端分别发生逆行溃变和顺行溃变，甚至跨神经元溃变。 手段有物理损伤和化学损伤 化学常见如：6-羟基多巴胺、6-羟多巴和木胺对儿茶酚胺能神经元；5-羟色胺、氯苯丙胺对5-HT能神经元；AF64A或ECMA对胆碱能神经元；红枣氨酸和鹅膏蕈氨酸等对兴奋性氨基酸类神经元等等。 酶组织化学和荧光组织化学 免疫组织化学 免疫电镜技术 原位杂交组织化学法 受体及转运体定位法 神经系统功能活动形态定位法 激光扫描共聚焦显微镜技术 利用酶对底物的催化作用使底物发生颜色变化，借此对该酶进行定位、定量分析。过程中需注意保存形态和保持酶活性。 常见有： 乙酰胆碱酯酶组织化学法 NADPH法 单胺类物质的荧光组织化学法 AChE是乙酰胆碱的分解酶，分布于神经元和肌组织等 原理：AChE分解底物，然后还原重金属盐捕获剂形成有色沉淀。 具体方法较多，但从抗胆碱乙酰基转移酶(ChAT)抗体出现后，此方法已较少见 一氧化氮