人RBP4基因cDNA全长的克隆,表达和纯化.docVIP

PAGE PAGE 11 人RBP4基因cDNA全长的克隆、表达和纯化 孙玉秀1，鲁云霞安徽省教育厅自然科学基金资助项目（No 2006kj371B）第一作者：孙玉秀（1981-），女，硕士研究生，E-mail： syx1981@；通讯作者：鲁云霞（1969-），女，副教授，研究方向：糖尿病的分子机理，Tel：0551-5161131，E-mail： luyunxia0514@1 安徽省教育厅自然科学基金资助项目（No 2006kj371B） 第一作者：孙玉秀（1981-），女，硕士研究生，E-mail： syx1981@；通讯作者：鲁云霞（1969-），女，副教授，研究方向：糖尿病的分子机理，Tel：0551-5161131，E-mail： luyunxia0514@ （1安徽医科大学基础医学院生化教研室，安徽 合肥 230032 2安徽省合肥市妇幼保健院，安徽 合肥 230001） 中国图书分类号：R345.61 摘要：目的 构建人视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因cDNA全长的原核表达质粒(pET-28a(+)-hRBP4)并在大肠杆菌中高效表达。方法　取成人正常肝脏组织提取总RNA，RT-PCR后的扩增产物回收，构建克隆载体pMD-RBP4，设计带酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的引物，PCR后酶切连入pET-28a(+)中，转化BL21(DE3)，测序后IPTG诱导表达，Western blot检测其特异表达，并对rhRBP4诱导表达时IPTG的浓度、时间和温度等条件进行了优化，进一步用镍亲和层析柱进行纯化，SDS鉴定其纯度。结果　测序证实所得的hRBP4cDNA序列与其在GenBank中的序列一致，重组质粒pET-28a(+)-RBP4的双酶切结果与预期大小完全一致，IPTG诱导后高效表达的蛋白质是其不溶性的包涵体形式；Western blot结果证实其高效表达的确实是RBP4。IPTG诱导的最佳浓度是0.04 mmol·L-1，时间为6 h，温度为37℃，镍亲和层析后经电泳证实其纯度可达96%。结论　成功克隆和构建了人RBP4基因的原核表达载体并对原核体系诱导表达的条件进行了优化，使其能在BL21(DE3)中高效表达，经亲和层析得到的纯化重组蛋白可用于制备相应的多 关键词:人视黄醇结合蛋白4；pET-28a(+)；高效表达；包涵体；镍亲和层析 Cloning, expression and purification of human RBP4 in E.coli SUN Yu-xiu1, LU Yun-xia1，WANG Ling-yun1, CHEN Bing1, CHEN Li-chun2, CHEN Guan-jun1 (1Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032，2Hefei Maternal and Child Health Hospital. Hefei 230001，Anhui, China) Abstract：Objective To construct the recombinant plasmid pET-28a(+)- hRBP4 with human retinol binding protein 4 (RBP4) full length cDNA sequence, to express the hRBP4 protein effectively in E.Coli. Methods Total RNA was isolated from the normal liver of human, then RBP4 were amplified by two-step RT-PCR. The cloning plasmid pMD-hRBP4 was constructed after retrieval of the amplification products, then RBP4 was subcloned with primers containing restriction endonucleases recognition sites of BamHⅠand Hind Ⅲ, ligated into pET-28a(+), transducted into BL21(DE3). After sequenced, the bacteria were induced with IPTG and proteins were expressed, identified with SDSand Western blot. Then inducti