肝癌c--met表达异常与索拉非尼耐药关系研究及肝癌了动物模型建立.docx

天津医科大学博士学位论文甲又捅要 天津医科大学博士学位论文 甲又捅要 第一部分肝细胞性肝癌患者HGF／c．Met表达特征评价 目的：检测原发性肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者血清肝 细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)水平及HCC组织c．Met蛋白表 达水平。 方法：通过双抗体夹心酶联免疫ELISA方法检测血清标本中HGF水平，通过 免疫组织化学方法检测肝脏病理标本c．Met蛋白染色强度。对肝癌组与肝硬化 组及健康人群组在HGF水平、c．Met染色强度等变量进行One．Way ANOVA统 计分析和Friedman非参数检验，评价肝癌组与其他两组间是否存在显著性差异。 结果：血清HGF浓度在肝癌组、肝硬化组和正常对照组分别为 0．609士0．134nNml、0．378士0．116ng／ml、0．271士0．083ng／ml，肝癌组患者血清HGF 水平明显高于肝硬化组和正常对照组，差异具有显著性(P0．01)。不同体积的 肿瘤之间血清HGF水平存在显著性差异(P0．05)，肿瘤体积越大则血清HGF 水平越高。c．Met蛋白在HCC组织上呈阳性表达，c．Met阳性染色主要定位于 肿瘤细胞的胞膜和胞质，而在癌旁组织及正常组织呈弱阳性和低表达，差异具 有显著性意义，P0．01。HCC组织c．Met阳性表达强度与肿瘤分化程度等密切 相关，(P0．05)。 结论： 1．HCC患者血清HGF水平较肝硬化及正常对照组明显升高，差异具有显著性。 2．HCC患者术前血清HGF水平与肿瘤大小有明显正相关性，肿瘤体积越大则 血清HGF水平越高。 3．c—Met蛋白在HCC组织中表达强度明显高于癌旁组织及正常肝组织，差异具 有显著性意义。 4．c．Met表达异常与HCC病理分化程度等密切相关。 第二部分c。Met过表达细胞株构建及索拉非尼耐药特征观察 目的：评价c—Met过表达导致的细胞信号传导异常对索拉非尼抑制肝癌细胞增 殖的影响并寻找相应治疗对策。 方法：首先通过慢病毒载体将c．Met基因转染至HepG2细胞，并使HepG2细 胞能够稳定表达c．Met蛋白，通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株 HepG2。met。通过MTT比色法法及AnnexinV-FITC和PI双染法检测细胞周期 及凋亡的方法，评价索拉非尼对HepG2细胞／HepG2．met细胞增殖影响是否存 在差异，确定c．Met蛋白表达异常升高对索拉非尼抵抗作用。通过Western Blot 方法检测c．Met蛋白及其下游mTOR信号蛋白P70S6K、4E—BPl磷酸化水平在 HepG2细胞／HepG2．met细胞之间的差异，寻找c．Met蛋白表达异常升高对索拉 非尼抵抗作用的分子机制。在此基础上通过联合mTOR抑制药物雷帕霉素逆转 索拉非尼耐药现象。 结果：通过RT-PCR检测慢病毒感染的HepG2细胞中c．Met mRNA确定慢病毒 天津医科大学博士学位论文转染MOI=20为最佳MOI值，通过2．5ug／ml嘌呤霉素持续作用10天筛选出抗 天津医科大学博士学位论文 转染MOI=20为最佳MOI值，通过2．5ug／ml嘌呤霉素持续作用10天筛选出抗 嘌呤霉素的稳定细胞株HepG2．met。Westem blot方法分析c．Met的表达和磷酸 化及mTOR信号途径中P70S6K、4E．BPl蛋白磷酸化改变，显示HepG2．met 细胞在c-Met的表达和磷酸化及P70S6K、4E．BPl蛋白磷酸化水平上均明显超 过HepG2细胞。通过细胞生长曲线检测发现HepG2．met具有较HepG2更为活 跃的细胞增殖能力。MTT法检测HepG2／HepG2一met细胞对索拉非尼增殖抑制 敏感性：索拉非尼对HepG2／HepG2．met细胞增殖抑制作用随着药物浓度的增 加而逐渐增加，表现出剂量依赖性；HepG2．met具有一定的索拉非尼药物作用 抵抗特征。通过流式细胞术检测可以看出HepG2．met细胞处于S期的比例为 65．5％，较HepG2细胞的39．92％明显升高，提示HepG2．met增殖更为活跃，在 应用相同剂量的索拉非尼作用后HepG2．met细胞S期比例降至41．07％，细胞凋 亡率为35．48％；HepG2细胞的S期比例降至25．89％，细胞凋亡率为63．42％， 两组间比较仍有显著性差异，提示索拉非尼对HepG2．met细胞增殖抑制作用有 所下降，HepG2．met表现出对索拉非尼一定的耐药性。当HepG2．met组联合应 用索拉非尼及小剂量的雷帕霉素后，S期比例降至32．03％，细胞凋亡率上升至 65．01％，提示雷帕霉素可以部分逆转HepG2．met细胞高表达c．Met造成的对索 拉