课件：五基因的克隆与分离.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * 先是利用mRNA的3′末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30 MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5′末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）作为上游引物，用一个基因特异引物2（Gene Specific Primer 2，GSP2）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5′末端的cDNA片段扩增出来。 * 利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物引导扩增已知序列的侧翼序列的反应。 * * * * * * * * 同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。 * * * * * 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 一、cDNA末端的快速扩增（RACE） 　　根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3‘端和5’端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义） 上节内容回顾 （二）经典RACE克隆原理： （一）RACE： 由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA 根据中间核心序列设计出5’特异性引物 与3’引物扩增第一链cDNA 可得到全长cDNA的3’末端序列 5’RACE 在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列 用oligo（dT）引发合成cDNA第一链 利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列 二、基因组文库的构建与基因分离 　　基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。 （一）基因组文库（genomic library） （二）基因组文库应满足的条件 1、文库的完整性 2、基因组信息的可重建性 3、文库的大小 （三）基因组文库构建的一般步骤 1、染色体DNA的分离 2、大片段的制备 3、载体的制备 4、重组连接 5、包装 6、重组噬菌体感染大肠杆菌 基因组文库 （四）基因组文库的筛选 筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来 探针筛选法：两步或三步原位杂交法 （一）cDNA library 　将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。 三、cDNA文库的构建与筛选 （二）cDNA文库应满足的条件 　　1、文库的代表性 　　2、序列的完整性 （三） 构建cDNA文库的一般步骤 （1）总RNA（total RNA）提取 （2）mRNA的分离纯化 （3）cDNA的合成 （4）cDNA与载体连接 （5）重组载体转化受体菌 ① 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 ② 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 ③ 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。 Genomic library与cDNA library区别 第四节 基因差异表达获得目的基因 　　在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。 　　真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15 000种不同的mRNA分子。　　 一、 差异显示PCR（DDRT-PCR） DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术 （1）3’ 锚定引物 Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M：A、