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实验1 大肠杆菌的培养和分离 高二年级班 姓名 学号：实验日期：_月 R 【知识准备】 背景知识： 大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）是微牛.物学和遗传学常用的实验材 料，为单细胞原核生物，宽约0.5X1-3微米；具有由肽聚糖组成的细胞 壁；周身具鞭毛，能运动。 大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的、不会致病的止常栖居菌，但若 进入胆囊、膀胱等处也会引起炎症。它能利用多种糖类物质产酸、产气, 其代谢类型为异养兼性厌氧型；其代谢活动能产牛大肠杆菌素（抑制肠道 内其他分解蛋白质的微生物生长），还能合成维生素B和K。它们在肠道中 大量繁殖，几乎占粪便干重的1/3。 实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基。按培养基的物理状 态可分为：液体培养基和固体培养基。将已知的菌种引入新配制的培养基 的过程称为接种。而在固体培养基表面用蘸有菌种的接种环连续划线，既 可以达到接种的目的，乂可以实现分离菌种的目的。这是因为划线过程中 接种环与培养基表血接触，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分 细菌间的距离加大，经过培养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落，这样 就达到了分离细菌的冃的。 实验原理： 使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养人肠杆菌, 使大肠杆菌迅速扩增。在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离, 经培养后培养基上每一个菌体会形成一个单独的菌落。这是消除污染杂菌 的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实 验过程屮耍进行无菌操作。 3.思考题 （1） 为什么培养过程中会出现被其他微生物污染的现象？ （2） 进行了无菌操作是否肯定就不会出现被其他微生物污染的现象 吗？ （3） 本实验的关键步骤一一划线分离的冃的是什么？ （4） 在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线 的末端开始划线?在操作过程中应注意什么？ 1 【实验目的】 利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增 用固体平面培养基进行大肠杆菌的划线分离 了解微生物实验的操作原理和培养条件 【材料用具】 大肠杆菌菌种 装有固体培养基的、己灭菌培养皿；装有LB液体培养基的、已灭菌 的250ml三角瓶封口膜和橡皮圈 酒精灯 接种环 银子 装有酒精 棉球的广口瓶 恒温培养箱摇床 【操作流程】 【实验步骤】 接种前的准备 进行接种操作前，应先洗手，再用70%的酒精棉球擦拭双手和桌面。 待酒精挥发之后，再点燃酒精灯。 接种 （1） 接种时的要求 接种过程要在酒精灯火焰附近完成，这是因为在火焰附近形成的上升 气流能避免空气屮的微生物落入培养基屮。 接种环灭菌：将接种环在酒精灯火焰的外焰灼烧灭菌。对金属丝与柄 部连接部位也要在火焰上穿梭1 — 2次。灼烧后的接种环温度较高，为避 免烫死菌种，可将英接触培养基或培养容器的内壁冷却后再取菌种。 （2） 将固体培养基表面的大肠杆菌菌种转入液体培养基培养 右手执接种环，在火焰上灭菌。用左手握住装有菌种的试管和液体培 养基的三角瓶靠近酒精灯火焰，并用右手中指■无名指夹下试管口的棉塞、 无名指■小指夹下三角瓶的封口膜，将试管口和三角瓶口在酒精灯的火焰上 烧灼灭菌后，再将接种环伸入试管，接触培养基冷却后取菌种。将菌种转 入三角瓶的液体培养基中；分别将三角瓶的封口膜和试管的棉塞复原，在 封口膜上标记好接种人和接种H期。 （3） 将液体培养基中的大肠杆菌菌种转入固体培养基中划线分离 接种时应以左手持培养皿，在火焰旁用左手拇指、 食指及中指使皿盖开启成一缝（培养皿盖不能开大， 以避免杂菌落入），用灭菌过的接种环取少许菌种迅速 送入培养1111内，在固体培养基的表血连续平行划线4? —5条，将培养皿转动一定角度后，用接种环通过第1??? 次划线的末端部分做第2次连续平行划线，然后再以 同样方法依次操作。（见右图） 划线时接种环应与培养基表面成30。左右，注意划线要轻，不可把培 养基划破，也不要使接种环碰到培养皿边缘。（见右下图） 2 3.培养 （1） 将接有菌种和液体培养基的三角瓶在摇床上振荡培养12h,温度 控制在37°C左右。 （2） 将划线后的固体培养基盖好，在培养1111盖上标记好接种人和接 种日期，再将培养皿在37°C恒温培养箱中倒置培养12-24ho 倒置培养的原因是：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式 蒸发，并在培养皿盖子内凝结成水滴，水滴如果滴落在培养基表面并扩散 开来，则会使不同菌落中的菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离 目的。 培养12-24h后，若在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌种 已被分离。 【实验记录】 请课代表将在37°C恒温培养箱中培养12-24h的培养结果用相机拍摄 下來，传给任课教师。 【结果分析】