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春季保护地小型西瓜苗期枯萎病与叶枯病初步鉴定 摘要：随着春保护地西瓜种植面积的扩大和工厂化育 苗的发展，西瓜苗期病害也越来越严重，有些常见于生长期 的病害，现在在苗期也有较重发生。对湖北省宜城市流水镇 育苗场采集的2份西瓜苗期病样，进行分离、纯化并回接病 原菌，然后利用PCR扩增真菌保守的ITS序列，初步确定所 采集病样1-a的致病菌为枯萎病病原菌[Fusarium oxysporum Schl. f. sp. niveum (E. F. Smith) Snyber et Hansen],病样1-b的致病菌为叶枯病病原菌[Alternaria cucumerina (Ell. et Ev. ) Elliott] o 本研究利用分子 鉴定手段，避免了传统分类方法的繁琐、耗时和结果不稳定 性等缺点。 关键词：西瓜；枯萎病；叶枯病；苗期病害 中图分类号：S436； S651文献标识码：A文章编号： 1001-3547 (2013) 16-0068-03 早春保护地西瓜上市早，价格高，经济效益好，近年来 在湖北发展较快，其对西甜瓜嫁接苗的巨大市场需求促进了 工厂化育苗的快速发展。但由于部分小型育苗场设施简陋， 环境调控能力差，加上不注重种子处理，苗期频发多种病害。 2012年3?4月，湖北省低温阴雨持续时间长，宜城市小型 苗场发病较重。湖北省农业科学院经济作物研究所对其中发 生较为普遍的2种病害进行了分离、鉴定，以期对其防治起 到指导作用。 1材料与方法 1供试菌株 从湖北宜城市流水镇育苗场西瓜苗上采集病样，图l-a 病样的病部有粉红色霉状物，图1-b病样的病部呈水渍状， 用组织分离法［1］分离病原菌，然后纯化、保存。 1.2致病性测定 根据柯赫氏法则［2］进行寄主活体接种，接种菌丝，以 清水为空白对照，3次重复。出现田间相同的症状时再次分 离，并将2次获得的分离菌作比较，以确定该菌病原菌。 1. 3 DNA提取 将病原菌菌块移至马铃薯蔗糖培养基(PSA)平板上， 25￡黑暗条件下培养48?72 h,然后将菌落边缘的菌丝切成 2?3 mm的菌落小块，把4?5块菌丝移至PSA液体培养基， 28°C. 180 r/min振荡培养2 d。将液体培养好的病菌菌丝, 在双层尼龙网上过滤，用水洗涤2次，以除去菌丝内的培养 液，收集菌丝，将其包好放在硅胶中过夜，吸干水分，用液 氮研磨成粉末，参照Knapp等［3］报道的CTAB (Cetyltrim-ethyl ammonium bromide ) 法提取病菌菌丝 DNAo PCR引物 病原菌rDNA的ITS区域PCR扩增选用的引 物分别为ITS-F和ITS-R,其碱基序列如下［4］： ITS-F (5‘ -GTCCTAACAAGGTTTCCGTA-3 ), ITS-R(5 -TTCTCCGCT TATTGATATGC-3)。 PCR混合物10 mmol/L三磷酸碱基脱氧核昔酸0.6 uL, 20 mmol/L 氯化镁 1.2 uL,缓冲液 2. 0 nL,加 10 umol/L 引物 ITS-F 和 ITS-R 各 1.0 uL,2U/uLTaq 酶 1.0 u L,模板1. 0 n L,使用超纯水将反应体系补至20 n Lo PCR反应 热循环参数设置为94工预变性4 min； 94°C 30 s, 56°C退火 30 s, 72°C延伸 90 s,循环 36 次；72°C 延伸6minoPCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到600 bp左右的条带，将病原菌基因组PCR扩增产物回收，回收片 段与克隆载体进行pGEM-T连接，然后转化至大肠杆菌DH-5a 感受态细胞，进行蓝白斑筛选，选取阳性菌落扩大培养后， 部分菌液用M13进行PCR扩增，凝胶电泳检测，并将检测后 确认含有目的片段的阳性克隆送到华大基因测序公司测序， 将测序结果提交GenBank进行分析。根据序列分析和形态学 鉴定的结果，对所分离的病原菌进行鉴定。 2结果与分析 1病原菌回接鉴定 菌丝接种第5天病部有粉红色霉状物(图2-a)和水渍 状(图2-b),与田间症状相同。从回接表现症状的病叶中再 次分离到病原菌。 2.2病原菌的rDNA-ITS序列验证 用病原菌rDNA的ITS区域进行扩增，均扩增出约600 bp 的特异性片段(图3)。测序后通过GenBank软件比对序列： 病样1-a分离获得的菌株1?2的rDNA ITS序列与Fusarium oxysporum的相似度达99%,而西瓜枯萎病的致病菌是尖胞 镰刀菌西瓜专化型(F. oxysporum Schl. f. sp. niveum (E. F. Smith) Snyber et Hansen),初步判断所得病菌为西瓜 枯萎病致病菌［5］。病样1-b分离获得的菌株3?4的r