广藿香叶片总蛋白双向电泳体系的建立.pdfVIP

— ３０６— 江苏农业科学　２０１６年第４４卷第３期 何丽平，吴友根，张军锋，等．广藿香叶片总蛋白双向电泳体系的建立［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（３）：３０６－３０９． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．０３．０８８ 广藿香叶片总蛋白双向电泳体系的建立 何丽平，吴友根，张军锋，胡新文 （热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室／海南大学园艺园林学院，海南海口５７０２２８） 　　摘要：比较２种方法提取广藿香叶片总蛋白质的得率与聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）蛋白条带，同时对广 藿香叶片总蛋白质双向电泳条件进行了优化，利用ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ和Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ软件对部分蛋白点进行质谱鉴 定。结果表明：使用ＴＣＡ／丙酮法提取广藿香叶片总蛋白，在 １０万Ｖｈｓ聚焦强度下，可获得高分辨率双向电泳图谱， ＢＰＰ酚抽法获得的蛋白不适用于双向电泳分析；经质谱成功鉴定了９个蛋白点，鉴定成功率９０％。 　　关键词：广藿香；叶片；双向电泳；蛋白质提取 ＋ 　　中图分类号：Ｓ５６７．２３９．０１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）０３－０３０６－０４ 　　广藿香［Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．］为唇形科刺 广藿香植物材料于２０１４年４月种植于海南大学园艺园 蕊草属植物，是我国常用中药，具有芳香化浊、开胃止呕、发表 林学院广藿香种质资源圃。当年１１月采集植株叶片，液氮速 ［１］ 解暑等功效 ，是著名国家中药保护品种藿香正气丸（胶囊、 冻保存，用于总蛋白质提取。 水）和抗病毒口服液的重要原料，也是其他３０多种中成药的 １．２　试剂 ［２］ 主要原料 。但是广藿香连作障碍现象十分突出，造成产量 三氯乙酸（ＴＣＡ）、尿素（ｕｒｅａ）、硫脲（ｔｈｉｏｕｒｅａ）、３－［（３－ 和品质明显下降，每茬收获后必须间种其他农作物后方可再 胆酰胺丙基）－二乙胺］－丙硫酸（ＣＨＡＰＳ）、十二烷基磺酸钠 种，严重影响了广藿香规范化生产与种植、药农种植积极性和 （ＳＤＳ）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、硫酸铵、考马斯亮蓝 Ｇ－２５０，购 区域经济发展，从而难以保障广藿香药材的质量及其标准化、 自美国Ｓｉｇｍａ公司。２４ｃｍＩＰＧ胶条（ｐＨ值４～７）和琼脂糖， 现代化的实施。据报道，广藿香连作障碍的原因可归结为根 购自瑞典ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司。丙烯酰胺（Ａｃｒ）、甲叉双丙烯 ［３］ ［４］ 系分泌物质的自毒作用 和根际微生物群落多样性变化 ， 酰胺（Ｂｉｓ）、交联聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰＰ），购自美国Ｂｉｏ－ 但无论何种机制，连作障碍现象都最终在广藿香植株上表现 ＲａｄＬａｂｓ公司。其他药品均为国产分析纯，购自北京化工厂。 出来。近年来，随着现代系统生物学的快速发展，差异蛋白质 １．３　方法 组学技术逐渐成为研究连作障碍机理的有力工具，其中蛋白 １．３．１　蛋白质样品的制备　分别称取广藿香叶片２份，每份 质双向电泳（２－ＤＥ）图谱的建立是进行蛋白质组学分析的前 １ｇ，分别放于预冷研钵中，加入适量 ＰＶＰＰ，用液氮研磨至粉 提和基础，而蛋白样品的制备则是双向电泳技术的核心与关 末，装入离心管，－８０℃冰箱中保存待用。广藿香叶片总蛋 键。本研究比较不同的广藿香叶片总蛋白提取与分离方法， 白提取流程按照ＴＣＡ／丙酮法、ＢＰＰ（四硼酸钠／交联聚乙烯吡 旨在为广藿香叶片差异蛋白质组学分析奠定基础，进而为揭 咯烷酮／苯酚Ｂｏｒａｘ／ＰＶＰＰ／Ｐｈｅｎｏｌ）酚抽法进行。 示广藿香连作障碍机制提供理论依据。 １．３．１．１　ＴＣＡ／丙酮法　参照Ｗａｎｇ等提取顽拗植物组织蛋