兔2－细胞胚胎电融合及其融合胚体外.PDFVIP

遗传学报128(6);493--9891993 流ctaCeneticaSinica 兔2-细胞胚胎电融合及其融合胚体外 发育的研究’ 刘 林 安 民 北（京农业大学畜牧系 100094) 本文对兔2一细胞胚胎卵裂球电融合制作四倍体胚胎的适宜条件进行了研究。 电场强度 为2.。千伏／厘米，脉冲时程为40微秒时，可获得最好的融合率 6〔8.9-100%}，平均为77.30x0() 及融合胚发育率(74.5%a)-,该发育率与受精卵体外囊胚发育率 7（9.3%a)相似。对于电融合及 融合胚发育，非电解质溶液 (0（.3mo1/L甘露醇＋0.1mmo1/L氯化钙+0.1mmo1/L硫酸镁）优 于电解质溶液 D（PBS)o融合后，72.7%的胚胎具有四倍体染色体。本实验所得出的兔2一细 胞胚电融合适宜条件可为兔胚胎细胞核移植技术中供体与受体细胞融合提供参数。 关键词 兔，2一细胞胚胎，电融合，四倍体 哺乳动物配子和早期胚胎细胞融合技术在研究卵子发生及早期胚胎发育中细胞核质 相互作用“，，‘在制作四倍体，【，，‘·，‘及‘胚胎细胞核移植1,〔17,20,24’等方面有贡要价值。以前用聚 乙二醇 (PEG）或灭活的仙台病毒融合细胞 “.191。但是，PEG融合红)1NI不同步，时间长， 且对细胞有毒性；仙台病毒处理繁琐，融合率不稳定，且影响细胞活力。而电融合物理参 数可精确固定，因而重复性好。细胞暴露于融合液中时间短，这对胚胎细胞存活尤为重 要。电融合是在短时间强电场作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻和 低通透特性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆性电击穿发生在两个相邻细胞的接触区 时，细胞膜相互融合，从而导致细胞融合叫。 但根据现有资料，很难确定兔胚胎细胞电融合恒定的最适条件及其融合胚的发育能 力。为配合胚胎核移植技术及制备遗传上多倍体胚胎，本文对兔2一细胞胚胎细胞电融合 所需的适宜条件进行了研究，进而对融合胚的体外发育能力及其染色体标本进行了观察 和分析。 材 料 和 方 法 一（）免2一细胞胚胎来源 实验兔为性成熟大耳白兔或青紫蓝兔，体重3.，公斤左右。按 Kennelly和Foote;ii 方法超排卵处理。P-FSH （中国科学院动物研究所产品）颈部皮下连续注射6次，每次相 隔10--14小时，每次用量0.15毫克。最后一次 FSH 后 10-14小时，耳静脉注射75单 本文于 1992年6月”日收到。 ＊本研究得到国家教委博士点基金的资助。还得到了陈永福教授、孙拓教授、张忠诚h}1i;1i教授的大力支持；戴蕴平 实验师,T-m3%t,李迎小姐对实验给予热情帮助。谨表衷心感谢。 竹4 贵 传 学 报 ZO卷 位HCG上（海生化制药厂产品），随即与公兔交配。交配后22-23小寸！，用改良的DPBSrI 冲输卵管，收集2一细胞胚胎。DPBS中洗2次，再在覆盖石蜡油的，0川培养液T〔CM193 (Gibco)＋10外小牛血清］小滴中洗2--3次，置于培养液小滴中待独合。事先将做好培 养小液滴的35mm培养皿置于含，多co,湿度空气的380C培养箱！；｛平衡1224小时。 1一细胞受精卵培养条件相同。 二（）电融合方法 电融合方法与Sun和Moorr2l]所描述的方法类似。交流电及直流脉冲由细胞电融 合仪 C（E450,Kefa)输出。作电极的2根圆柱形不锈钢丝 直（径0.5mm）平行固定在有 机玻片凹槽内，间距0.5mm，构成电融合小室。先将2一细胞胚胎在包！融合液中平衡，一 10分钟，然后移至充满电融合液的2根电极之间，尽量使胚胎细胞界面与电极方向平行。 施以交流电AC(10V摊MHz)，约10秒，体视镜下可见胚胎泳动，界面排列成与电极平 行，且界面间接触紧密。再施以一定场强和脉冲时程的直流矩形脉沂皮‘DCo 三（）融合过程观察及融合胚体外培养 DC脉冲电击后的胚胎在融合小室内静止片刻，在培养小液滴中洗3次，再按上述受 精卵培养条件培养。2