全内反射荧光显微镜讲义.ppt

* * * * * * * * * * * * * 全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势(它的荧光激发深度只在～100 nm 的薄层范围内),从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求;另一方面它的图像解释相对于近场,干涉显微成像来说也较简单。 现在全内反射荧光显微术已被广泛用于 实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( FRET) ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动 全内反射荧光显微术的发展一方面会在加强传统优势的基础上，即动态观察生物大分子的结构、相互作用、物质的分泌，同时在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其他仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。 全内反射荧光显微术在生物单分子科学中的应用 单分子荧光探测主要有三个问题： （1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。 （2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。 （3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。 这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决 全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰。 全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术 利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。 单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。 如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。 2.蛋白分子相互作用 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。 单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。 3.离子通道研究 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离子电流和电化学势。 单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。 目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。 4.吸附 用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分子吸附行为 。 全内反射荧光显微镜下拍到的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分子图 分别在全内反射荧光显微镜下（左）和一般荧光显微镜（右）拍到的Dil-stainedneuron,细胞。 全内反射荧光显微镜（TIRFM）是研究紧贴固体平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对结果的解释具有一定的困难性。 因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。 The application of the total internal reflection fluorescence microscopy 解依荻 全内反射应用的核心问题 全内反射应用的核心问题是制作与电子显微术（EM）切片尺寸相当的光学切片。 共焦技术 VS.全内反射技术 共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深度分别为～500－800nm。 全内反射显微术: 典型的垂直照明深度100nm。 结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。 全内反射的应用 在生物单分子研究中的应用 直接观察细胞表面的生命活动,而不受细胞深层区域信号的干扰. 全内反射荧光显微术的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 全内反射的应用比较 与其他生物单分子研究技术的比较 全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM） 全内反射的应用比较 全内反射荧光显微镜（TIRFM） 全内角反