乳与乳制品非常规理化指标检验维生素B6的测定.doc

乳与乳制品非常规理化指标检验维生素B6的测定 YLNB 5.12 1. 范围 本方法规定了用反相液相色谱法测定维生素B6的方法。 本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B6的测定。 2.原理 样品经热水萃取等前处理后，经C18色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量维生素B6(吡哆醇 、吡哆醛、吡哆胺)的含量。 3. 试剂 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。 3.1 高峰氏淀粉酶 3.2 盐酸溶液为:5mol/l 3.3 氢氧化钠溶液为:5mol/l 3.4 冰乙酸:优级纯 3.5 无水甲醇:色谱纯 3.6 辛烷磺酸钠:优级纯 3.7 三乙胺体积分数≥99.9% 3.8 标准溶液 3.8.1 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准贮备溶液浓度均为200ug/ml。 准确称取吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准品各用水溶解并定容至容量瓶中。 3.8.2 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准工作溶液，浓度均为2.0 ug/ml。 取1.0ml标准贮备溶液（3.8.1），用水定容至100ml。 4. 仪器 4.1 超声波振荡器。 4.2 高压液相色谱仪：带荧光检测器。 4.3 色谱柱：30×4mm，C18或具有同等性能的色谱柱。 4.4 酸度计。 5. 方法 5.1 样品预处理 5.1.1 含淀粉的样品 精确称取 5.0g 样品，放人150mL锥形瓶中，加入0.5g Taka淀粉酶(3.1)，再加入25mL45- 50℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶内空气，盖上瓶塞，置450℃烘箱内30min，取出冷却至室温。 5.1.2 不含淀粉的样品 精确称取5.0g 样品，放入150mL锥形瓶中，加入25mL60℃的蒸馏水，振摇，静置5-l0min，使样品充分溶解并降至室温。 5.2 测定液的制备 5.2．1 用盐酸溶液（3.2）慢慢调节样品溶液的pH值至1.70 ，放置约1min，再用氢氧化钠溶液(3.3)调节样品溶液的pH值至4.50。 5.2.2 将样品溶液转移到50mL容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于50mL容量瓶中，并用水定容至50mL. 5.2.3 把上述容量瓶放人超声波水浴(4.1)中，振荡10min 5.2.4 另取50mL容量瓶，上面放入三角漏斗和滤纸，把样品溶液倒入其中，自然过滤。滤液再经0.45 um微孔滤膜加压过滤，用试管收集，即为样品待测液。 5.3 色谱条件 检测灵敏度:0.002AU/ MV 检测器条件:荧光激发波长Ex:293nm，发射波长Em:395nm。 柱温 :30℃ 流速 : 1.00mL/min 流动相 : 体积分数为5.0%的甲醇、0.20 g/l00mL辛烷磺酸钠、体积分数为25%的三乙胺水溶液，用乙酸调pH= 3.00 。 5.4 定量分析(外标法) 注射一定量的标准工作液(3.8.2)进入色谱仪，得到组分i的峰高(或峰面积)Ai，注射等体积的样品待测液进入色谱仪，得到组分i的峰高(或峰面积)Bi。 6. 结果计算n 样品中维生素B6的含量(mg/l00g)= X醇 + X醛+ X胺······(1) 注:样品中维生素B6是各组分的含量之和. 样品中各组分含量(mg/100g)= 式中:Bi— 样品组分i的峰高或面积； Ai — 标准工作液中组分i的峰高或面积； C — 标准工作液中组分i的质量浓度，ug/mL； m — 样品的质量，g； V — 样品溶液体积,mL。 7. 允许差 同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%.