乳与乳制品病原微生物检验方法奶粉阪崎肠杆菌的检验.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法奶粉阪崎肠杆菌的检验 YLNB 4.7 1. 仪器及器材 水浴锅：循环系统使温度保持在45.5±0.2℃。水的高度应高于浸入试管 的中部。 浸入式温度计：1-55℃，长度大约是55 cm，精确度为0.1℃。 培养箱：35-37°C和 24-26°C。 吸管：1、5和10 ml，精确度为0.1 ml。 L玻璃棒（如曲棍球棒状）：直径为3-4 mm.，可涉及45-55 mm的区域。 接种环：环的直径为3 mm。 天平：量程为2 kg、精确度为0.1g。 灭菌样品处理器具：取样勺，剪刀，开罐器 样品稀释瓶：规格为100ml、125 ml、 160 ml、250 ml、2L 1.10 菌落计数器：或是其类似物，带有放大镜。 1.11 API 20E生化鉴别系统。 1.12 灭菌平皿：15 x 150 mm或直径90mm。 1.13 VITEK生化鉴定系统或类似设备。 2. 培养基和试剂 胰蛋白大豆琼脂（TSA）：准备好的中间体可在2-8°C条件下贮存4周以 上。 紫罗兰红胆盐葡萄糖琼脂（VRBG琼脂）：加该成分至1升蒸馏水中，（加 经过滤过的浓度为1%染液），加热到沸腾并搅拌直到所有成分溶解为止。对该中间体不必进一步消毒。冷却到45°C并倒入平皿中，平皿的直径最好为15 cm。如果不是立即使用，贮存琼脂在5-8 °C。这个中间体在脱水情况下可以商业形式应用(Oxoid, CM0485);可在容器中直接激活使用。准备好的中间体可在2-8°C条件下贮存4周以上。 酵母粉 3.0 g 蛋白胨 7.0 g 氯化钠 5.0 g No. 3胆盐 1.5 g 乳糖 10.0 g 中性红 0.03 g 紫罗兰结晶物 0.002 g 琼脂 15.0 g 葡萄糖 10.0g EE肉汤：加入干净的公牛胆汁和亮绿防止对数量不多活力不强的肠细菌 细胞造成抑制。溶解该成分在1升蒸馏水中，加热到沸腾，然后分成90 ml的体积。这个中间体在脱水情况下可以商业形式应用(Oxoid, CM0317); 可在容器中直接激活使用。准备好的中间体可在2-8°C条件下贮存4周以上。 蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 5.0 g 磷酸氢二钠二水化合物 8.0g 磷酸二氢钾 2.0 g 公牛胆汁 20.0 g 亮绿 0.015 g 2.4 氧化酶测试试剂： 3. 方法： 3.1 检验程序： 样品100g加入900ml无菌蒸馏水 样品100g加入900ml无菌蒸馏水 36±1℃ 18-22h 10ml加入90ml肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤） 10ml加入90ml肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤） 36±1℃ 18-22h VRBGA VRBGA 36±1℃ 18-22h 或 显色培养基（Xa-GlcA）平板TSA平板 显色培养基（Xa-GlcA）平板 TSA平板 25±1℃ 48-72h 36±1℃ 18-22h 革兰氏染色 氧化酶试验 API 20E生化鉴定试剂盒、VITEK生化鉴定系统或其他 革兰氏染色 氧化酶试验 API 20E生化鉴定试剂盒、VITEK生化鉴定系统或其他 报告 报告 3.2检验步骤 3.2.1取样前消毒样品包装的开启处和取样勺。无菌称取样品100g至2L的样品稀释瓶中，加入900ml预热到45℃的灭菌蒸馏水，或者将样品直接称量到装有9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水的样品稀释瓶中，振摇使样品充分混匀，36±1℃培养18-22h。 3.2.2 移取培养18-22h的悬液10ml，加入90mlEE肉汤中，36±1℃培养18-22h。 3.3.3轻轻混匀增菌液，用直接划线法进行平板接种：每份增菌液用3mm接种环 （10ul）分别接种2个VRBGA平板或2个Xa-GlcA平板，三区法或四区法划线， 以得到单个菌落。将平板置36±1℃培养18-22h。 3.3.4 观察平板上阪崎肠杆菌的典型形态： 在VRBGA平板上：紫色菌落周围有一圈紫色的胆汁酸沉淀环，圆形，凸起， 直径2mm-3mm。 （图片来源于Sharon Edelson Mammel） 在Xa-GlcA平板上：蓝绿色菌落，圆形，直径1mm-2mm。 3.3.5 在VRBGA平板上挑取5个可疑菌落分别接种到5个TSA平板，25±1℃ 48-72h 。 典型菌落是黄色的（图片来源于Sharon Edelson Mammel） 3.3.6 从Xa-GlcA平板挑取5个可疑菌落，革兰氏染色，做氧化酶试验。革兰氏 染色阴性，氧化酶阴性，应用API 20E生化鉴定试剂盒或